班布特罗左旋异构体对动物哮喘模型的药理学研究

发布时间：2019-11-12 15:52

【摘要】： 班布特罗消旋体(Racemic bambuterol, rac-BM)是用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺疾病的β2受体激动剂,rac-BM是特布他林的前体药,是近年上市的一种长效类β2受体激动剂,口服后在体内经血浆丁基胆碱酯酶水解释放出特布他林发挥支气管扩张作用,半衰期长,疗效可持续24小时以上,且副作用少,适用于夜间哮喘及老年哮喘患者的治疗,具有很大的应用价值。传统的β2受体激动剂如沙丁胺醇,虽起效快,但持续时间短(仅4～6h),频繁应用易产生耐药或出现哮喘恶化现象[1]。更为重要的是,长效的β2受体激动剂除舒张气道平滑肌外还具有强大的抗炎作用,这对于慢性哮喘和慢性阻塞性肺病的维持治疗和预防发作有着重要意义。目前β2受体激动剂在临床哮喘治疗中应用广泛且种类较多。β2受体激动剂的化学结构中大多含有手性碳原子,除了已开发上市的左旋沙丁胺醇外,其他多以消旋体(等量左旋体和右旋体的混合物)形式应用于临床。一般来说,手性药物的左旋体对疾病具有治疗效果,而右旋体非但没有治疗作用,甚至可能产生与药效相反的不良反应,如特布他林右旋体具有增强呼吸道对过敏性抗原敏感性的作用从而加剧哮喘症状。将消旋体药物进行化学拆分,分别得到左旋体和右旋体。消旋班布特罗体(rac-BM)经化学拆分得到班布特罗左旋异构体(R enantiomer bambuterol, R-BM)(该药2009年12月已通过SFDA审评,获得化学药物一类新药的临床研究批准文件)。R-BM作为rac-BM的一种拆分异构体[2],继承了rac-BM所有优点,如长效性、服用方便性、病人依从性、经济实惠性、以及数十年临床应用所证实的药物安全性等。更为重要的是,R-BM作为国家化学药物一类新药,相较于rac-BM,具有更强大、更持久的气道舒张作用,更显著的抗气道过敏性炎症的活性,以及更低的不良反应。左旋体上述种种优势与班布特罗消旋体中拆分去除右旋异构体(S-enantiomer bambuterol, S-BM)是密切相关的。本研究通过建立动物哮喘模型,从整体状态、离体器官直至细胞水平等不同角度,系统的评价了R-BM对哮喘治疗的作用效果及其特点,以期阐明研发R-BM的意义和价值所在。本文先后分别以rac-BM、S-BM为对照品,侧重从以下五个方面评价药理作用: 1.从豚鼠哮喘发作的症状入手,以跌倒率和引喘潜伏期为观察指标,评价R-BM对清醒状态下豚鼠哮喘发作症状的控制和缓解程度。 2.从豚鼠哮喘发作时肺功能变化入手,以气道阻力(RL)和动态肺顺应性(Cdyn)为检测指标,评价R-BM对麻醉状态下致敏豚鼠肺功能变化的改善作用。 3.从豚鼠气道平滑肌舒缩功能入手,以R-BM对离体气管平滑肌和离体肺条收缩的抑制效应为检测指标,评价R-BM对呼吸道平滑肌的舒张作用。 4.从气道炎症反应以及药物可能的抗炎作用入手,通过检测小鼠哮喘模型肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞计数的变化,评价R-BM作为一种新型长效β2受体激动剂,对气道过敏性炎症的抑制作用。 5.从班布特罗右旋异构体入手,首先比较R-BM与S-BM对豚鼠哮喘模型肺功能的影响,从而先明确这两种异构体对哮喘治疗的不同作用;接着通过长期用药实验,从β2受体激动剂连续应用平喘作用下降的角度,比较R-BM与其右旋异构体(S-BM)对豚鼠哮喘模型肺功能的影响,从而明确这两种异构体对哮喘反复用药后的治疗效果,初步探讨哮喘动物对β2受体激动剂产生的耐受现象通过以上五个方面的实验系统评价R-BM对动物实验性哮喘的治疗作用的优势。方法与结果: 1.班布特罗左旋异构体对豚鼠哮喘影响的整体实验研究评价一种平喘药物的作用效果,最直观简便的实验方法就是观察药物对哮喘发作症状的缓解程度和维持时间。观察哮喘发作时动物出现的喘息、气急、咳嗽、呼吸困难等症状,以跌倒率和引喘潜伏期为主要检测指标。而鉴于哮喘病因的多样化,本实验选用两种引喘剂作为喘息诱发因素:组胺和卵白蛋白。 ⑴班布特罗左旋体对组胺诱发豚鼠哮喘的作用 ①量效关系试验观察不同剂量R-BM对致痉剂组胺引发哮喘的抑制效应,以潜伏期大于360s者为阴性反应,不再继续观察。经测试R-BM在4.0 mg.kg~(-1)剂量下呈100%抑制组胺诱发的豚鼠哮喘发作时的跌倒现象, rac-BM在8.0mg.kg~(-1)剂量下方可100%抑制组胺诱发的豚鼠哮喘发作时的跌倒现象。R-BM在1.0～4.0 mg.kg~(-1)下对组胺诱发豚鼠哮喘发作的潜伏期值与对应剂量下的rac-BM相比都有极显著性差异(p0.01)。R-BM对组胺诱发豚鼠喘息发作的抑制作用呈明显的剂量依赖性,半数有效量(ED50)为1.625±0.876mg.kg~(-1);其效应强度明显强于rac-BM(ED50为2.639±1.329mg.kg~(-1))。 ②时效关系试验检测相同剂量R-BM在不同时间对组胺引喘的抑制效应,结果显示R-BM抑制组胺诱发豚鼠哮喘的作用在给药后4h达到峰效应,R-BM给药后1h、4h、12h的引喘潜伏期值与rac-BM比较均有显著性差异(p0.05)。 ⑵班布特罗左旋异构体对卵白蛋白诱发豚鼠哮喘的作用卵白蛋白致敏豚鼠建立哮喘模型,与组胺引发的哮喘有所不同,这是一种典型的过敏性哮喘模型。由于这种模型的重现性比较差,即同一只豚鼠若在短时间内多次引喘其对卵白蛋白的反应性下降,易出现动物对卵白蛋白的耐受现象从而影响实验结果的精确性。所以本模型仅以量效关系实验为主。结果显示R-BM在0.5～8.0 mg.kg~(-1)呈剂量依赖性的延长哮喘发作的潜伏期和抑制哮喘发作时跌倒现象的发生,与rac-BM相比有显著性差异(p0.05)。R-BM对OVA激发哮喘发作抑制效应的半数有效量(ED50)为2.46±1.28mg.kg~(-1);而rac-BM的ED50为4.29±2.01 mg.kg~(-1)。上述所有实验结果表明R-BM抑制由诱喘物质引发的豚鼠哮喘反应,缓解哮喘豚鼠气急、咳嗽、呼吸困难等症状,延长引喘潜伏期,减少豚鼠跌倒数量。R-BM从对以上哮喘症状的控制程度上表现出较之rac-BM更强大、更优越的平喘作用。 2.班布特罗左旋异构体对哮喘豚鼠肺功能影响的实验研究毫无疑问,跌倒率和引喘潜伏期是评价支气管舒张剂平喘作用的经典检测指标,但其实验设计、所用动物模型和实验方法比较简单,并有一定的局限性,如药物抑制组胺引发的豚鼠哮喘发作,这可能只能说明该药有抗组胺的作用,并不能直观的说明药物的支气管舒张作用。所以本实验进一步选用肺功能检测作为整体实验的深入研究部分。从豚鼠哮喘模型的气道阻力(RL)和动态肺顺应性(Cdyn)等肺功能检测指标入手,观察R-BM抑制麻醉状态下致敏豚鼠的RL的上升和Cdyn的下降,评价其舒张气道平滑肌的作用强度。模型组豚鼠在抗原激发后1～30min内RL平均值较抗原激发前上升了149%±97%,Cdyn平均值较抗原激发前降低52%±13%。R-BM与rac-BM分别以4.0,2.0,1.0mg.kg~(-1)灌胃给药(ig),R-BM呈剂量依赖性抑制过敏性抗原卵白蛋白引发的支气管收缩反应,其中气道阻力ID50为1.22mg.kg~(-1),动态肺顺应性ID50为0.91mg.kg~(-1);rac-BM亦呈剂量依赖性抑制抗原引起的支气管收缩反应,测得气道阻力ID50为2.16mg.kg~(-1),动态肺顺应性ID50为1.14mg.kg~(-1),由此可见R-BM对卵白蛋白诱发的哮喘反应的抑制效应强度强于rac-BM。上述结果表明R-BM通过改善哮喘豚鼠的肺功能状态,使抗原激发后的高气道阻力现象得到控制,有效地缓解哮喘发作,改善通气功能。肺功能该项指标客观评价了R-BM对哮喘豚鼠的支气管收缩的抑制作用,且效果较rac-BM更好。 3.班布特罗左旋异构体对豚鼠气道平滑肌作用的离体实验研究在整体实验的基础上,结合离体实验能够更全面更系统的评价R-BM的对支气管肺组织舒张作用强度。从豚鼠离体器官水平入手,观察R-BM拮抗离体状态下豚鼠气道平滑肌和肺条收缩反应,以R-BM对离体气管平滑肌和离体肺条收缩的抑制效应为主要检测指标。结果表明: R-BM在灌胃给予50～200mg.kg~(-1)4h后所取得的含药血清,呈剂量依赖性的抑制His所致气管平滑肌和肺条的收缩,其抑制效应强度与对照组相比有极显著性差异( P0.01),与rac-BM比较有极显著性差异( P0.01)。上述结果表明R-BM抑制组胺诱发的豚鼠离体气道平滑肌和离体肺条的的收缩,表现出强大的舒张气道平滑肌作用,其作用效应明显强于rac-BM。 4.班布特罗左旋异构体对哮喘小鼠气道炎症作用的实验研究支气管哮喘是有多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。炎症细胞包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等。其中嗜酸性粒细胞是哮喘发生中的主要效应细胞之一,它能分泌释放多种神经毒素和细胞毒性蛋白颗粒,引起气道上皮和肺组织的广泛性损伤,导致气道上皮剥离和支气管高反应性[3,4]。气道嗜酸性粒细胞炎症模型已成为研究哮喘病理的最重要的动物模型。本实验直接采用了抗原攻击致敏小鼠引起的支气管肺炎症细胞聚集模型,通过计数支气管肺泡灌洗液中白细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴/单核细胞,表明R-BM具有强大的抗气道炎症活性。从实验结果可见,模型组经卵白蛋白攻击后,白细胞总数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞淋巴细胞数均有非常明显的增多,嗜酸性白细胞数目增多最为明显。表明致敏小鼠抗原攻击引发哮喘之后,产生一个明显的过敏性炎症反应过程,支气管肺组织中大量炎症细胞浸润。R-BM1～4mg.kg~(-1)剂量灌胃给药能显著抑制致敏小鼠抗原攻击后支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数的升高,表现出较rac-BM更好的抗炎活性。 5.班布特罗左旋异构体与右旋异构体对豚鼠哮喘不同作用的比较实验研究一般来说,手性药物的左旋体有治疗作用,而右旋体不但没有治疗作用,甚至可能产生与药效相反作用。前三部分实验结果表明R-BM对哮喘的治疗效果显著优于rac-BM,在此基础上,进一步研究左旋体与右旋体对哮喘治疗作用的差异,从而探讨研发班布特罗左旋体的意义和临床价值所在。 (1)单次口服班布特罗左旋体与右旋体对哮喘豚鼠肺功能影响通过R-BM、S-BM对肺功能影响,评价两者对支气管平滑肌的舒张效果:肺功能测试结果表明灌胃给予R-BM1.0,2.0,4.0 mg.kg~(-1),可显著改善气道阻力的上升与肺顺应性的下降,呈剂量依赖性抑制抗原引起的支气管收缩反应,与S-BM比较,差异有显著性。S-BM以1.0,2.0,4.0 mg.kg~(-1)灌胃给药后支气管舒张作用微弱甚至几无作用,未显示明确的剂量依赖性效应。值得注意的是,虽然小剂量S-BM(1.0 mg.kg~(-1))对哮喘豚鼠肺功能有一定的改善作用,表现出对引喘后支气管收缩的抑制,但随着剂量的增加,S-BM的这种抑制作用呈减弱趋势。与模型组相比,S-BM低剂量(1.0 mg.kg~(-1))和中剂量(2.0 mg.kg~(-1))对抗原引起的支气管收缩反应的具有微弱的抑制作用,而且中剂量的抑制率低于低剂量,而S-BM高剂量(4.0 mg.kg~(-1))则表现出较模型组更为剧烈的支气管收缩效应,包括气道阻力的上升和动态肺顺应性的下降。这可能是由于S-BM可增加气道对过敏性抗原的敏感性,从而加剧气道收缩反应(已证实右旋特布他林可增加气道对过敏性抗原的敏感性)。从这个意义上说,口服大剂量的S-BM与引发哮喘的卵白蛋白具有协同作用。 ⑵连续口服班布特罗左旋体与右旋体对哮喘豚鼠肺功能影响 14天连续灌胃分别给予R-BM和rac-BM后,在第15天均给予R-BM一次灌胃后,观察豚鼠肺功能的变化,推测β2受体调节的敏感性是否改变。结果表明:R-BM和S-BM连续用药均可使R-BM对豚鼠哮喘的治疗效果减弱,推测豚鼠在长期口服β2受体激动剂后对R-BM产生耐受现象。综合上述结果分析,S-BM不仅没有R-BM所具备的强大支气管平滑肌舒张作用,而且大剂量S-BM表现出较模型组更为剧烈的支气管收缩效应,这种现象可能与S-BM增加气道对过敏性抗原的敏感性有关。S-BM这些特性非但不利于哮喘的治疗,甚至可加重哮喘,诱发重症哮喘或哮喘持续状态。由此可见将rac-BM进行化学拆分,剔除S-BM,获得纯化的R-BM是有其独特的意义和临床价值的。R-BM作为一种长效、强效、安全、服用方便、经济实用的临床一类新药,一定可以为哮喘患者的治疗带来福音。
【图文】：

模型组OVA激发前后的肺功能变化

-BM高剂量对OVA激发前后豚鼠肺功能变化的影响
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R965

【引证文献】