三种抗CHO细胞残留蛋白抗体的制备、鉴定、纯化与初步应用

发布时间：2019-11-13 18:32

【摘要】： 宿主细胞蛋白是生物体产生的与重组药物无关的蛋白成分。为定量分析CHO细胞表达的重组蛋白药物中的残留宿主细胞蛋白,本文采用冻融法制备了中华仓鼠卵巢(CHO)细胞可溶性细胞蛋白,分别免疫鸡、兔和羊三种动物获得高免鸡蛋和抗血清。ELISA检测水稀释蛋黄上清,摸索抗体水平消长规律并筛选高效价鸡蛋。采用水稀释鸡蛋卵黄,结合60%冰乙醇和25%冰乙醇两步沉淀法纯化鸡抗CHO细胞蛋白IgY。琼脂免疫双扩散和ELISA检测纯化的鸡IgY和兔羊血清效价,Western blot检测三种抗体与CHO细胞蛋白的覆盖度。选取效价高、覆盖度高的兔羊血清,分别用辛酸硫酸铵沉淀,蛋白A／G亲和纯化和抗原偶联亲和纯化三种方法进行纯化,SDS-PAGE鉴定抗体纯度,ELISA检测抗体效价变化。同时用胃蛋白酶水解兔羊IgG获得F(ab’)2,并用凝胶过滤纯化。采用改良过碘酸钠法标记抗体并凝胶过滤纯化。最后,用制备的抗体和酶标记物摸索ELISA检测CHOHCP的方法。纯化后的鸡IgY和免疫后获得的最高效价兔羊血清ELISA效价分别为104,107,106,兔羊血清琼脂免疫双扩散效价分别为1：128和1:32。Western blotting结果表明兔羊血清对免疫原覆盖度高,鸡抗CHO细胞蛋白IgY覆盖度差。纯化后鸡IgY的SDS-PAGE纯度可达99%。兔羊血清经辛酸硫酸铵沉淀后抗体纯度分别为64.7%和61.6%；辛酸硫酸铵沉淀纯化后的兔羊IgG再经蛋白A／G亲和纯化后,纯度分别为81.3%和83.5%。蛋白A／G亲和纯化后抗体效价下降了约1个数量级。兔羊血清经抗原偶联亲和纯化后,特异性抗体比例增加,SDS-PAGE显示纯度分别为68.3%,和80.6%。胃蛋白酶水解制备的兔和羊F(ab’)2纯度分别为65.6%和71.2%。兔IgG和羊IgG的标记率分别为39.4%和55.4%,克分子比值分别为1.58和1.716。间接ELISA检测线性范围为19.53-1250ng/mL,夹心ELISA检测灵敏度达78.13ng/mL。已成功制备高效价抗CHO HCP的兔血清和羊血清,并分别进行了纯化。ELISA检测CHO HCP的方法还有待进一步摸索。
【图文】：

凝胶电泳,可溶性蛋白,跨度,分子量

1.2cHO细胞可溶性蛋白鉴定 CHOHCP经SDS一PAGE凝胶电泳后，显示是一典型的混合蛋白，，可清晰分辨的条带达五十余条。分子量范围跨度从IOK一25OK(见图2)。

水溶性蛋白,蛋黄,组分,乙醇沉淀

2纯化鸡IgY纯度鉴定选取筛选的ELISA高效价鸡蛋进行水稀释，然后分别用印%冰乙醇和25%冰乙醇沉淀后，纯度有了显著提高，还原505一队G〔显示有两条带(见图3)，分子 123MkD嘛、赫250蝙 130毓豁100釉辫70蘸涵553525图3纯化IgY的SDS一PAGE Fig3SDS一 PAGEofPurifiedIgYM.预染蛋白质分子量标准;1.水稀释蛋黄上清;2.水溶性蛋白组分(wSF);3.纯化后IgY;
【学位授予单位】：武汉生物制品研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】