肝窦状内皮细胞分离纯化和永生化

发布时间：2019-11-13 23:07

【摘要】： 目的：建立小鼠肝窦状内皮细胞(sinusoidal endothelial cells, SEC)的分离培养方法,研究其生物学特性。方法：中性蛋白酶(dispase)消化小鼠肝组织,Percoll密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞选择培养基及酶差异消化法纯化SEC；免疫细胞化学染色检测SEC的表面标志,电镜分析SEC的超微结构,观察DiI荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL)摄取能力以及体外成血管能力分析SEC的功能。结果：分离纯化后的细胞呈典型鹅卵石样内皮细胞形态,这些细胞表达内皮细胞特征性标志vWF,但不表达CD31以及间质细胞和上皮细胞的表面标志,具有窦状内皮细胞特征性的窗孔结构,Weibel-Palade小体；能摄取DiI-Ac-LDL,并有一定的成血管能力。结论：建立了一种分离、培养SEC的方法,为研究SEC的功能奠定了基础。目的：研究自发永生化肝窦状内皮细胞生物学特性方法：5-溴-4氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷(X-gal)染色检测衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated (3-galactosidase SA-(3-Gal)活性。免疫细胞化学染色和流式细胞术检测永生化SEC的表面标志,细胞生长曲线分析永生化SEC的增殖能力。DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(Acetylated-Low Density Lipoprotein, DiI-Ac-LDL)摄取能力、体外成血管能力分析永生化SEC的功能。染色体核型分析永生化SEC遗传稳定性；软琼脂体外培养、SCID小鼠体内接种观察永生化SEC体内外成瘤性,Western blot分析永生化SEC P53蛋白表达水平的改变。结果：在体外培养8代后,SEC发生衰老。衰老细胞继续培养约40天左右,衰老细胞层上出现新的圆形、折光性强的新生细胞,这些细胞呈克隆性、多层生长,且随传代次数的增加,增殖能力增强,与永生化细胞特性一致。表达内皮细胞特征性标志物vWF和CD31,也表达间质细胞标志CD90、CD105和desmin;能摄取DiI-Ac-LDL,但失去成血管能力；体内外均无成瘤性,P53蛋白表达明显增加。结论：肝窦状内皮细胞在体外培养条件下自发永生化。
【图文】：

免疫表型分析,免疫荧光染色,绿色

爆口杏·_、图1一 1SEC的形态特征注:图1一 1sEc的形态(x100)。A:原代sEc的细胞形态;B:纯化sEc细胞形态。图1一 2sEC免疫表型分析注:A:vwF免疫细胞化学染色 (x400);B:CD31免疫荧光染色(cD31，绿色;I)Apl，蓝色)(X20o);C:CK19免疫荧光染色(CK19，，绿色;DApl，蓝色)(xZoo);x):eD90免疫荧光染色(CD90，绿色;DApl，蓝色 )(X200);E:CDIOS免疫荧光染色‘CD105，绿色;DAPI

荧光,管结构,学位论文

硕l一‘学位论文附l冬]图1一 3SEC吞噬Ac一LDL荧光结果份i:SEC摄取DII一Ae一 IJDL(X100)。A:f)API(、流色):B:细胞摄取DII一Ae一LDL(爹，色);C:A干 1IB合j戊。碑豁盖一岁熟‘产声节一叮一衅;/:一认_…健口心亘庵翻.吞‘也图1一 4SEC体外成血管实验结果八:S盯体外形成而一竹的能力(X40)。A:4h细胞形成山L管结构;11:(ih细胞形成血管结构;〔’:I()h红f}胞形成If!!_乍育·结构:f〕:12h红{{j泡形j戊If{}牛窍二爹，，，构:E:14h细胞形j戊血管结构:F:阳性对照内皮fll_细胞4h!}寸形成而管结构。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】