肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用

发布时间：2019-11-14 00:23

【摘要】：目的验证肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和热休克蛋白Dna J的相互作用。方法 PCR扩增S.pn D39 GAPDH蛋白编码基因gap全长,将其克隆至p ET-28a(+),重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导GAPDH-6His的表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE鉴定其纯度。重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体。Western blot鉴定GAPDH的保守性。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layer Interferometry,BLI)验证GAPDH和Dna J的相互作用。结果获得了纯度达90%的GAPDH重组蛋白,并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体,Western blot检测显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带。大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和Dna J共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长,提示二者在细菌胞内有相互作用。直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加,二者的结合量也增加,提示GAPDH和Dna J的结合具有浓度依赖性。BLI实验也显示GAPDH和Dna J的亲和常数为1.12×10-7mol/L。结论糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达,且为分泌性蛋白;该蛋白和热休克蛋白Dna J在细胞内存在相互作用,且为直接相互作用。
【图文】：

p→500bp→250bp→100bp→M12000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→M122000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→ABCDEFG←1008bp←4400bp←1008bp←1119bp←1008bpA:靶质粒pTＲG-gapPCＲ扩增M:DL2000标准;1:靶质粒pTＲG-gapPCＲ扩增产物;B:靶质粒pTＲG-gapBamHⅠ及XhoⅠ双酶切M:DL2000标准;1:靶质粒pTＲG-gapBamHⅠ及XhoⅠ双酶切产物;C:靶质粒pTＲG-gap及诱饵质粒pBT-dnaJ共转化E．coliXL1-BlueMＲF'KanPCＲ鉴定M:DL2000标准;1:gap扩增产物;2:dnaJ扩增产物;D:平板示意图1:实验组共转化菌;2:系统自带阳性对照共转化菌;3:已知阳性对照共转化菌;4:阴性对照质粒共转化菌;5:阴性对照质粒共转化菌;E:非选择平板(含Tet，，Cam);F:3-AT平板(含Tet、Cam、3-AT);G:双选择平板(含Tet、Cam、3-AT、Strep)图4大肠杆菌双杂交验证GAPDH和DnaJ的相互作用1633第37卷第16期2015年8月30日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol．37，No．16Aug．302015

2.01.51.00.50D（450）值00.6251.252.55.010.0DnaJ+GAPDHBSA+GAPDHGAPDH（μg）图5直接结合实验验证GAPDH和DnaJ的相互作用2．7BLI验证GAPDH和DnaJ的相互作用在300s之前，GAPDH和DnaJ的结合呈浓度梯度依赖的关系，随着GAPDH浓度的增加，二者结合增加，与直接结合实验结果一致。在300s之后，开始缓慢解离，最后达到结合解离平衡(图6)。通过octeＲED96分子互作仪相对应软件计算二者相互作用参数，得出GAPDH和DnaJ相互作用的结合常数达2．91×103(mol·s)－1，解离常数达3．25×10－4s－1，亲和常数达到了1．12×10－7mol/L，说明二者具有较强的结合力和较高的亲和力，再次证明GAPDH和DnaJ具有直接的相互作用。0.800.750.700.650.550.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050GAPDH结合量(nmol)050100150200250300350400450500550600650700时间（t/s）4.8μmol2.4μmol1.2μmol0.6μmol0μmol图6BLI验证GAPDH和DnaJ的相互作用3讨论蛋白相互作用的验证是进行其功能研究的基矗我们前期研究显示，DnaJ可能参与GAPDH的非经典分泌［15］，需要确证二者是否有相互作用。目前有多种鉴定蛋白相互作用的方法，包括酵母双杂交系统、细菌双杂交系统、免疫共沉淀、直接结合实验、BLI等，在进行相互作用研究时需要根据实情进行考虑。酵母双杂交系统是基于真核细胞转录因子的作用原理而建立的［18］。细菌双杂交系统是利用转录激活的原理检测蛋白质之间的相互作用，能在活体内鉴定蛋白质的相互作用，具有高度敏感性，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能检测到的优点。与酵母双杂交相比，细菌的转化效率显著高于酵母

【参考文献】

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1 王哲;王建敏;马峰;张帅;黄远帅;张雪梅;;肺炎链球菌SpxB蛋白的细胞表达定位、保守性分析及其生物学功能初探[J];第三军医大学学报;2014年14期

【共引文献】

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本文编号：2560551