【摘要】： 目的肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体之一,且常并发多种神经系统症状,甚至导致患者死亡。目前对EV71重症感染尚无有效的预防与治疗手段。本研究采用从六安地区手足口病患儿标本中分离病毒的方法得到EV71地方流行株;再采用分子生物学技术以该地方株的基因组为模板,扩增EV71衣壳蛋白VP1基因全长,构建VP1基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)"VP1,转染COS-7细胞并表达;通过肌肉注射免疫BALB"c小鼠,观察pcDNA3.1(+)"VP1诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为预防EV71感染寻找新的有效途径。 方法本研究主要分为三部分内容:⑴EV71地方株的分离与鉴定:首先将采自33例临床诊断为手足口病的患儿的51份标本(其中咽拭子33份,疱疹液12份,脑脊液6份)接种Vero细胞进行病毒分离。将分离得到的可疑病毒株利用透射电镜进行形态学观察,用EV71型特异性免疫血清及型特异性引物分别进行中和试验及RT-PCR检测,以对分离物进行EV71型别鉴定;⑵VP1基因真核表达载体的构建:提取分离并经鉴定证实为EV71的1株地方株19-Luan-CHN-08的基因组RNA,以其为模板采用RT-PCR法扩增VP1基因片段全长,将其插入至pMD18-T simple克隆载体,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。并将序列与EV71 BrCr株VP1基因序列比较其同源性。将测序正确的VP1基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),命名为pcDNA3.1(+)"VP1,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行PCR鉴定及酶切鉴定。将pcDNA3.1(+)"VP1转染COS-7细胞,用Western blot法和RT-PCR法检测VP1基因在COS-7细胞中的表达;⑶重组真核表达载体pcDNA3.1(+)"VP1的免疫活性初步研究:将pcDNA3.1(+)"VP1免疫18只6-8周龄BALB"c小鼠,共免疫三次,小鼠随机分为A, B和C 3组,每组6只,其中A组为实验组,每只小鼠分别在第0、2和4周经双后肢股四头肌注射pcDNA3.1(+)"VP1重组质粒DNA 100μg,B组为空载体阴性对照组,每只小鼠分别在第0、2和4周经双后肢股四头肌注射pcDNA3.1(+)空质粒100μg,C组为PBS空白对照组,每只小鼠分别在第0、2和4周经双后肢股四头肌注射无菌PBS 100μl。每次免疫前24h,于每只小鼠双后肢股四头肌注射0.75%盐酸布比卡因30μl。分别于每次免疫前经鼠尾静脉采血收集血清,末次免疫后的第2周眼眶取血收集血清并处死小鼠,取各组小鼠脾细胞。间接ELISA法检测各组小鼠血清中的特异性EV71 VP1抗体水平,中和试验检测其抗EV71的中和效应,MTT比色法测定T淋巴细胞的增殖反应以检测细胞免疫水平。 结果⑴本次研究中,14例患儿咽拭子标本分离阳性,阳性率为42.4%(14/33),其中2例患儿的疱疹液标本同时阳性,阳性率16.7%(2/12),共分离培养得到14株病毒分离株。透射电镜观察,在Vero细胞胞浆内可见有直径约30nm的球形无包膜肠道病毒样颗粒;而中和试验及型特异性引物RT-PCR检测结果证实其中6株为EV71,分别命名为01-Luan-CHN-08、06-Luan-CHN-08、11-Luan- CHN-08、13- Luan-CHN-08、14-Luan-CHN-08和19-Luan-CHN-08;⑵成功克隆了VP1基因片段全长,测序结果表明与EV71 BrCr株RNA同源性达98.4%,氨基酸同源性达96.3%。将此VP1基因片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)"VP1,RT-PCR检测到VP1 mRNA表达,Western blot检测表明pcDNA3.1(+)"VP1转染的COS-7细胞裂解液中出现一条约34KD的蛋白条带,与EV71 VP1蛋白分子量一致,其可被EV71 VP1多克隆抗体特异性识别;⑶在用pcDNA3.1(+)"VP1免疫的BALB"c小鼠血清中,初次免疫后2周特异性IgG抗体水平即有明显增高,OD450值为0.218,以后随免疫次数增加而逐渐增高,末次免疫后2周OD450值为0.559,经统计学分析,与B组及C组比较差异有显著性(p 0.01);中和试验结果显示pcDNA3.1(+)"VP1免疫的BALB"c小鼠血清可在体外对EV71产生中和效应;三次免疫后,脾淋巴细胞增殖反应测定,A组小鼠T淋巴细胞增殖活性升高,刺激指数分别为:A组(2.410±0.12)、B组(1.400±0.21)、C组(1.241±0.19),A组与B组及C组比较差异有显著性(p0.01)。 结论⑴EV71是此次六安地区HFMD主要病原体之一,采用Vero细胞株培养可对其进行有效分离,其中咽拭子标本阳性分离率最高,其次为疱疹液标本,脑脊液标本阳性分离率最低;⑵成功构建了EV71地方分离株VP1重组真核表达载体pcDNA3.1(+)"VP1,并证实该重组载体在COS-7细胞中获得表达,且表达产物具有抗原性;⑶小鼠注射重组真核表达载体pcDNA3.1(+)"VP1后可获得一定程度的特异性体液免疫和细胞免疫应答,免疫小鼠血清可中和EV71病毒,抑制其致细胞病变效应。本研究为进一步研制EV71核酸疫苗奠定了一定的实验基础,将有助于对EV71感染的预防与控制。
【图文】：
图 1 咽拭子标本病毒分离结果 (未染色，，×100)Fig 1 The results of virus isolation of throat swab(not stain, ×100)A：正常 Vero 细胞 A：Normal Vero cellB：咽拭子标本引起的 Vero 细胞病变效应B：CPE on Vero cell infected with throat swab表 1 不同标本病毒分离结果Tab 1 The results of virus isolation of different samples标本来源 总份数 阳性份数 阳性率（%）咽拭子 33 14 42.4疱疹液 12 2 16.7脑脊液 6 0 0.0
射电镜下观察 Vero 细胞胞浆中的病毒颗粒（pellets in Vero cell by transmission electron micros和试验（固定抗血清-稀释病毒法）鉴定病毒分e results of neutralization test (Fixed anti-serum-d病D50阴性血清组病毒CCID50lg(抗血清组病毒毒810-7210-7.3810-7110-6.8210-7810-6.9810-6.7810-6.86-7.5
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R373
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 杨国威,何雅清,薛颖,周世力,马骊,金奇;肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达[J];病毒学报;2003年02期
2 姚英民;谢健屏;赖桂香;方焕生;;广州地区儿童肠道病毒71型分离与鉴定[J];南方医科大学学报;2008年10期
3 周世力;李琳琳;何雅青;;肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达[J];分析科学学报;2007年02期
4 周世力;李琳琳;何雅青;;肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达[J];华中师范大学学报(自然科学版);2007年02期
5 杨帆,金奇,何雅青,李良成,侯云德;肠道病毒71型中国分离株全基因组核苷酸序列分析[J];中国科学(C辑:生命科学);2001年02期
6 ;Molecular epidemiology and evolution of worldwide enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 2004[J];Chinese Science Bulletin;2007年11期
7 唐启慧;田新贵;林斌;向开军;周荣;;肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达[J];热带医学杂志;2008年01期
8 李艳秋,余莉,方草晖,张文艳,王明丽;HCMV pp65 DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫应答[J];安徽医科大学学报;2003年02期
9 李秀珠,胡家瑜,丁晓光,张家琪;上海市手足口病患者肠道病毒71型的分离[J];中国计划免疫;2003年01期
10 杨智宏,朱启昒,李秀珠,王晓红,王建设,胡家瑜,唐伟,崔爱利;2002年上海儿童手足口病病例中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的调查[J];中华儿科杂志;2005年09期
本文编号：
2561718
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shiyanyixue/2561718.html
