糖基化修饰的脐血内皮祖细胞在骨折模型中定向归巢能力的研究

发布时间：2019-11-16 10:15

【摘要】：第一部分人脐血来源CD34+内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及集落形成特性 目的：骨再生及修复中干细胞的应用是一种新兴的治疗策略。近年来内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）移植被认为是骨创伤及全身性骨疾病（如骨质疏松、先天性的骨发育不全等）最具潜力的治疗方法。但目前对EPCs的鉴定国内外存有争议，一种为形态上呈“纺锤样”的内皮细胞集落形成单元（endothelial cellcolony-forming units, CFU-ECs），另一种呈“鹅卵石样”的内皮克隆形成细胞（endothelial colony-forming cells, ECFCs）。本研究拟分离、培养及鉴定人脐血来源的CFU-ECs与ECFCs，并对其进行鉴别界定和成血管能力研究，了解两者的生物学差异。 方法： 1.收集健康新生产妇脐血，肝素抗凝，用等量的PBS稀释，离心后取中间白膜层，用Easysep免疫磁珠（MACS）人CD34细胞正选试剂筛选。 2.应用流式细胞术对比ECFCs和CFU-ECs两种细胞表面抗原的表达差异性。 3.以EPCs的标志性基因为引物，应用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptionPCR, RT-PCR)技术对比两种细胞基因水平差异。 4.应用细胞免疫荧光检测两种细胞表面标志分子蛋白水平的表达。 5.Dil-Ac-LDL摄取、集落形成及细胞成血管实验等多种方法对比两类细胞功能方面的差异性。 结果： 通过流式检测发现ECFCs和CFU-ECs表达相同内皮细胞表面抗原，如 VEGER-2、CD31、CD144、CD105和CD146。而CD45和CD14在两者的表达存在 明显差异，CFU-ECs表面强表达，ECFCs表面几乎检测不到。基因水平、蛋白水平 也证明上述结论。另外两者在集落形态、细胞增殖能力、Dil-Ac-LDL摄取和体外成血管能力等方面均存在明显差异；ECFCs可见多个散在“鹅卵石样”集落形成，而CFU-ECs为梭形细胞排列呈放射状，细胞功能方面ECFCs在摄食Dil-AC-LDL，成血管方面作用明显，而CFU-ECs却没有这些细胞功能。 结论： CFU-ECs可能是造血干细胞源性的细胞集落，并非真正的EPCs。而ECFCs具有很好的成血管能力，为真正意义上的EPCs，在组织工程和临床等方面有极大的应用 前景。 第二部分重组岩藻糖级转移酶VI过表达对内皮祖细胞归巢能力影响的研究 目的：近年来研究发现EPCs在促进裸鼠骨折愈合及骨痂形成方面有显著效果。EPCs用于骨折治疗的关键环节是其必须定向归巢到缺血骨折区域，EPCs滚动、粘附、归巢到损伤部位是由P-选择素(P-Selectin)和E-选择素(E-selectin)与其共同的配体P-选择素糖蛋白配体(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)的相互作用介导的；据Hidalgo发现干细胞的PSGL-1不能有效地与P-Selectin和E-selectin结合，但细胞的体外糖基化可以明显提高PSGL-1与选择素的结合能力，如果通过糖基化修饰能够修正EPCs的这一功能缺陷，将会大大提高EPCs的归巢能力和骨疾病的治疗价值。 方法： 1.用脂质体转染法将pPROTA-TA为载体的人岩藻糖基转移酶(α1-3fucosyl-transferase VI, FTVI)表达质粒转入EPCs。 2.转染48h后用流式细胞仪检测EPCs表面sLex结构，验证细胞表面糖基化效率。 3.采用流式细胞仪分析EPCs、糖基化处理的EPCs(fucosytransferase VI treatedEPCs, FUT-EPCs)与P-Selectin的结合率。 4.在裸鼠股骨中段骨折模型中将PBS (contorl组)、EPCs（正常组）、FUT-EPCs （实验组）分别注入骨折裸鼠尾静脉；通过组织切片对比三组EPCs的归巢能力。 结果：1.流式细胞术检测转染48h后EPCs、FUT-EPCs的sLe~x结构率，结果显示转染 效率由未转染前的4.8%上升到32%以上，且未发现明显的细胞凋亡。2.流式结果检测EPCs、FUT-EPCs与P-Selectin的结合率；EPCs为5%，FUT-EPCs 上升为19%。3.裸鼠骨折局部软组织切片；HE染色、免疫组化及组织免疫荧光结果显示，骨折区域的血管腔及内皮可见人EPCs的特异标志蛋白，三组中FUT-EPCs组局部EPCs 特异蛋白表达水平显著高于其他各组。 结论：FUT-VI基因过表达可上调EPCs表面sLe~x表达，促进EPCs和选择素的结合，从而提高EPCs在裸鼠骨折局部的归巢能力，促进骨折愈合。
【图文】：

图 1 ECFCs 和 CFU-ECs 的分离和培养 CD34+内皮祖细胞的鉴定式细胞仪分析（Flow Cytometric Analysis）收集 9×1×105个培养的四代 ECFCs 和 CFU-ECs，1000 rpm 离心 ，1000 rpm 离心 5 min；弃上清，每管加入 100 μL1%BSA 室温一遍，1000 rpm，1000 rpm 离心 5 min；弃上清，将两种细胞分只样品管，两组样品管依次加入 H2O、VEGER2-PE、CD31-PE、C、CD105-FITC、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-PerCP（用含液按 1:100 稀释）；对照管加入 100 μL0.1%BSA；用流式细胞美国 BD 公司）检测细胞表面分子标记，每个样本收集分析 100疫荧光染色（Immunofluorescence Staining）把 3.5cm2盖玻片用酒精灯烧灼灭菌，放入 3.8cm212 孔板内入，分

图 2 CFU-ECs 和 ECFCs 的细胞集落形成能力, Bar=100 μm.3.2 流式、细胞免疫荧光及 RT-PCR流式结果发现 ECFCs 和 CFU-ECs 共同表达部分内皮细胞表面标志，如 C05、CD146 和 VEGFR-2 等内皮标志, 结果见图 3A。但 CFU-ECs 表面造血志 CD45 和吞噬细胞标志 CD14 高表达；ECFCs CD34 阳性率达 75%，而 CF率为 9%；CD14 及 CD45 阳性率较低，分别为 5 %和 9 %，（图 3B）。A
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

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本文编号：2561789