骨髓间充质干细胞调控肝星状细胞增殖、凋亡和RhoA表达的研究

发布时间：2019-11-19 07:37

【摘要】： 目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对多种原因引起的肝损伤具有显著修复作用,可改善甚至逆转肝纤维化,但逆转肝纤维化的机制未明。肝星状细胞(HSCs)的激活在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。因此,深入探讨骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及作用机制,具有重要意义。通过观察体外大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖、凋亡和RhoA表达的影响,探讨BMSCs旁分泌肝细胞生长因子(HGF)在其中的作用机制。 方法贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传代至第4代使用；大鼠肝星状细胞(HSC-T6)系及纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔塑料细胞培养盒,在半透膜(transwell insert)上层接种MSCs(1×105)cells／well,在下层接种HSC-T6细胞(1×105)cells/well,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。实验分组：①空白对照组：HSCs单独培养；②实验对照组：纤维原细胞(Fiberoblasts)与HSCs共培养；③MSC组：’BMSCs与HSCs共培养；④C-met抗体预处理组：兔抗C-met多克隆抗体500ng／ml预先封闭HSCs表面C-met受体6h后,BMSCs与HSCs共培养。以上体系培养观察24h和48 h,于倒置相差显微镜下动态观察HSCs细胞形态；免疫组化法检测HSCs a-SMA表达。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测共培养体系0h、24h、48h HSCs增殖能力；流式细胞术Annexin-V-FITC/PI双染法检测共培养体系24h、48h HSCs凋亡；RT-PCR、Western blot检测共培养体系0h、24h、48h HSCs内RhoA mRNA和RhoA蛋白的表达。收集BMSCs与HSCs共培养、单独BMSCs、单独HSCs培养体系24h、48h时间段上清液,-80℃冰箱保存,酶联免疫吸附法(ELISA)检测共培养上清液中肝细胞生长因子浓度。 结果1.BMSCs对HSC增殖具有抑制作用,BMSCs与HSCs共培养后24h、48h的HSCs增殖抑制率分别为(12.21±2.55)%与(35.43±6.17)%。BMSCs在24h已抑制大鼠肝星状细胞的增殖,48h明显抑制大鼠肝星状细胞的增殖并呈现时间依赖性。MSCs组与空白对照组、实验对照组和C-met抗体预处理组比较有统计学差异(P0.01)。2.BMSCs与HSCs共培养24h、48h后HSCs的凋亡率分别为(7.20±1.70)%与(25.80±3.60)%,BMSCs明显促进24h、48h时间段大鼠肝星状细胞的凋亡,与空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组比较有统计学差异(P0.01)。3.BMSCs与HSCs共培养后,RT-PCR法检测共培养24h、48h后HSCs中RhoA mRNA表达分别为(0.68±0.08)与(0.40±0.03)。BMSC组共培养24h后,RhoA mRNA的表达受到抑制；48h时抑制则更为明显,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,与上述三组比较有统计学差异(F0.01)。4. Western blotting检测BMSCs与HSCs共培养24h、48h后HSCs中RhoA蛋白的表达分别为(0.76±0.06)与0.43±0.05)。BMSC组共培养,24h后,RhoA蛋白表达即受到抑制；48h时抑制则更为明显,且显著低于空白对照组、实验对照组与C-met抗体预处理组,与上述三组比较有统计学差异(P0.01)。5.ELISA检测BMSCs与HSCs共培养24h、48h上清液中HGF浓度分别为(250±35)pg／m1与(570±80)pg／ml,明显高于单独BMSCs培养和单独HSC培养,与上述2组比较有统计学差异(P0.01)。 结论BMSCs与HSCs共培养能抑制HSCs的增殖,促进凋亡,抑制RohA表达,其机制是通过BMSCs旁分泌HGF发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖,促进凋亡和抑制RhoA表达的作用。可能是BMSCs抗肝纤维化作用的分子机制之一。
【图文】：

HGF浓度进行检测。BMSCS与HSCs共培养上清液中HGF浓度为(250士35)pg/ml与(570士80)pg/ml，明显高于单独BMseS培养和单独HseS培养，，与单独BMSCS、单独HSCS培养比较有统计学差异(只0.01)(表5，图7)。

一nC一et抗体预处理后共培48h
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【引证文献】

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1 雷香丽;佟明华;张建;王亚萍;孔祥平;;不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝硬化的作用研究[J];华南国防医学杂志;2012年03期

本文编号：2562991