电磁场促进骨髓间充质干细胞成骨分化及初步机制

发布时间：2019-11-19 09:12

【摘要】： 目的：(1)体外培养骨髓间充质干细胞,并鉴定骨髓间充质干细胞。(2)通过检测电磁场对骨髓间充质干细胞成骨分化指标的影响,研究电磁场促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的效应。(3)研究电磁场对骨髓间充质干细胞向成脂肪分化影响。(4)研究电磁场对骨髓间充质干细胞信号通路的影响,并探讨电磁场激活的信号通路同电磁场促成骨效应间的联系。 方法：用梯度离心+反复贴壁培养法培养和纯化骨髓间充质干细胞,取纯度较高且活性良好的P4-P6代细胞作为我们研究的靶细胞。 (1)采用多向分化诱导和流式细胞检测骨髓间充质干细胞表面标志物等方法对所取骨髓间充质干细胞进行鉴定,以确定所取细胞为骨髓间充质干细胞。 (2)通过PNPP法检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR和实时定量PCR检测骨髓间充质干细胞多种成骨指标：ALP、RUNX2、BMP2、BSP、DLX5的表达,免疫组化检测Ⅰ型胶原的表达,Von Kossa染色法检测钙结节的形成等方法探讨电磁场促进骨髓间充质干细胞成骨分化的效应。 (3)通过RT-PCR和实时定量PCR检测成脂肪指标的表达、western blot检测PPARγ蛋白的表达,油红O染色检测脂肪滴的形成,检测电磁场对骨髓间充质干细胞成脂肪分化的影响。 (4)通过Western Blot、ELISA等方法检测电磁场对MAPK、AKT、cAMP-PKA等信号通路的影响,找出相关激活的信号通路及作用位点。 (5)通过加入信号通路抑制剂或激动剂,检测在抑制或活化信号通路的条件下电磁场促成骨效应的变化,探讨电磁场激活的信号通路同其促成骨效应间的联系。 结果：(1)所取细胞在倒置显微镜下观察呈成梭形或多角形,有较好的折光性；生长迅速,常成簇状,集落状生长。在成骨诱导培养基作用下21天后可形成大量钙结节,在成脂肪诱导培养基作用下14天后有大量脂肪滴的形成。流式鉴定结果显示,CD90+,CD45-；CD29+,CD45-的表达率均在95%以上,而CD45+阳性的表达率小于5%,这表明其基本不含造血细胞系,细胞均一性良好,符合骨髓间充质干细胞表面标记物特征。 (2)电磁场作用三天后明显促进碱性磷酸酶活性的表达,促进Ⅰ型胶原的表达,多种成骨指标：ALP、BMP2、DLX5、BSP、RUNX2等mRNA的表达在电磁场作用三天后表达明显升高。在成骨诱导培养基的作用下,15天和21天钙结节染色电磁场作用组较对照组钙结节数目明显增多。 (3)RT-PCR及实时定向PCR显示电磁场作用下,成脂肪分化指标PPAR-γ2、adipsin、AP2等mRNA下调;PPAR-γ2蛋白表达下调；脂肪滴的形成减少。 (4)电磁场作用细胞15min、30min、60min、120min后检测cAMP、PKA、ERK1/2、P38、JNK.AKT等信号通路位点,结果显示电磁场增加cAMP和PKA的表达；促进磷酸化ERK1/2和P38的表达；而对JNK和AKT等磷酸化表达没有影响。加入PKA抑制剂H-89及ERK1/2抑制剂PD98059后,检测电磁场促成骨指标表达变化,显示加入通路抑制剂抑制电磁场激活的信号通路将明显抑制电磁场的促成骨效应。 结论： (1)通过梯度离心法+反复贴壁分离法可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞。 (2)电磁场可以促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。 (3)电磁场抑制骨髓间充质干细胞向成脂肪细胞分化。 (4)电磁场激活骨髓间充质干细胞内cAMP-PKA信号通路和MAPK信号通路,激活的这些信号通路同电磁场促成骨分化效应相关。
【图文】：

在倒置显微镜下骨髓间充质干细胞成梭形或多角形，有较好的折光性;生一长迅速，常成簇状，集落状生长，待培养至7天左右，细胞即开始融合，，需予以传代培养。见图1。2.流式鉴定结果以CD90、CD45、CD29等为标一记物双标骨髓间充质干细胞，其表面标志物鉴定结果如下图2。流式鉴定结果显示，CD90+，CD45~;CD29+，CD45一的表达率均在95%以上，而CD45+阳性的表达率小于5%，这表明其基本不含造血细胞系，细胞均一性良好，符合骨髓间充质干细胞表面标一记物特征。3.成骨分化细胞传代培养

11000100Q09000800070006000500040003000200010000〔二二习对照组七22习任MF组

本文编号：2563020