Rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用

发布时间：2019-11-20 05:19

【摘要】：目的观察Rho激酶在培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔(fasudil,F)对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法原代培养出生1~2 d的SD乳鼠心肌细胞,并行肌钙蛋白抗体免疫荧光染色鉴定,建立缺血再灌注损伤(I/R)模型。实验分3组:①正常对照组;②I/R组;③I/R+F组:建立I/R模型前20 min加入法舒地尔,使其终浓度分别为10μmol/L(F1组)、30μmol/L(F2组)、50μmol/L(F3组)。Western blot分别检测缺血2 h,再灌注3 h肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)磷酸化水平,作为Rho激酶功能活化的标志。应用流式细胞仪Annexin-V/PI双色法检测再灌注3、6 h时点心肌细胞的凋亡率。结果再灌注3 h后MYPT1的磷酸化水平明显增加,I/R组为正常对照组的5.7倍(P0.01),F1、F2、F3组法舒地尔干预后较I/R组分别减少24.6%、40.1%、60.1%(P0.05);法舒地尔组再灌注36、h心肌细胞的凋亡率较I/R组同时间点显著下降,随给药浓度的增加,细胞凋亡率呈下降趋势。结论Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中有促凋亡作用,法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生,从而发挥良好的心肌保护作用。
【图文】：

频率图,细胞图,原代培养,激酶

倒置相差显微镜下少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动,细胞伸出的伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或单层细胞(图1),搏动规则而同步,频率约80~100次/min。用肌钙蛋白抗体行免疫荧光染色证明心肌细胞纯度达90%以上,提示经差速贴壁后获得绝大多数为心肌细胞(图2)。图1　原代培养乳鼠心肌细胞(×200)Fig.1　Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes(×200)图2　乳鼠心肌细胞肌钙蛋白免疫荧光染色(×200)Fig.2　Immunofluorescent labeling of troponin in neonatal rat car-diomyocytes(×200)2.2　Western-blot检测Rho激酶蛋白表达　Rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物磷酸化MYPT1(P-MYPT1)水平。心肌细胞缺血2 h再灌注3 h后,对照组、I/R组、I/R+F1组、I/R+F2组、I/R+F3组Rho激酶蛋白表达情况见图3,提示各组均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相对表达量以Rho激酶蛋白与β-actin Western blot电泳条带辉度比值表示。设对照组为100%,I/R组与药物干预组为正常对照组的倍数,见图4。I/R组磷酸化MYPT1水平是正常组的5.7倍(P<0.01)

组分图,肌钙蛋白,免疫荧光染色,激酶

80~100次/min。用肌钙蛋白抗体行免疫荧光染色证明心肌细胞纯度达90%以上,提示经差速贴壁后获得绝大多数为心肌细胞(图2)。图1　原代培养乳鼠心肌细胞(×200)Fig.1　Primary cultured neonatal rat cardiomyocytes(×200)图2　乳鼠心肌细胞肌钙蛋白免疫荧光染色(×200)Fig.2　Immunofluorescent labeling of troponin in neonatal rat car-diomyocytes(×200)2.2　Western-blot检测Rho激酶蛋白表达　Rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物磷酸化MYPT1(P-MYPT1)水平。心肌细胞缺血2 h再灌注3 h后,对照组、I/R组、I/R+F1组、I/R+F2组、I/R+F3组Rho激酶蛋白表达情况见图3,提示各组均有Rho激酶激活。Rho激酶蛋白相对表达量以Rho激酶蛋白与β-actin Western blot电泳条带辉度比值表示。设对照组为100%,I/R组与药物干预组为正常对照组的倍数,见图4。I/R组磷酸化MYPT1水平是正常组的5.7倍(P<0.01),说明RHO激酶在心肌细胞缺血再灌注后有明显的激活。用F1、F2、F3组法舒地尔干预后,磷酸化MYPT1水平较I/R组分别降低24.6%、40.1%、60.1%,差异具有统计学意义(P<0.05).提示心肌细胞I/R后有Rho激酶激活

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