环孢素A单克隆抗体的研制

发布时间：2019-11-21 03:09

【摘要】：目的:研究环孢素A完全抗原的合成及单克隆抗体制备的方法。 方法:室温搅拌条件下,在脱水剂1-乙基-(3-二甲丙胺基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的作用下,将环孢素A与4-苯甲酰苯甲酸的共轭物(CsA-BBa)与聚L-赖氨酸(PL)按质量比为3.4:1的比例进行反应。反应产物用截留量1万的透析膜透析分离、纯化。在190-300nm范围内对合成抗原进行紫外图谱扫描鉴定;用5μg/ml的抗原包被酶标板,酶联免疫吸附法(ELISA)进行抗原特异性鉴定。用完全抗原免疫七周龄雌性BALB/C小鼠, ELISA法检测免疫小鼠血清抗体效价。在50%聚乙二醇(PEG)的作用下,将高效价小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合(脾细胞:骨髓瘤细胞=10:1)并接种于24 h前准备的饲养层细胞培养板中,HAT培养液对融合细胞进行选择性培养,用ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选、鉴定。 结果:环孢素A完全抗原(CsA-BBa-PL)紫外吸收峰峰位209.5nm,较合成原料物质CsA-BBa(212nm)及PL(203nm)发生了明显迁移,证实了产物的生成;环孢素A完全抗原ELISA特异性检测结果与阴性对照的比值为23.22。免疫BALB/C小鼠血清效价值为:3.35,3.43,3.37,3.31,3.38,空白对照、阴性对照、阳性对照值依次为0.080、0.42、3.43。免疫小鼠血清效价测定结果明显大于空白对照及阴性对照值,并与阳性对照值接近。所筛选的杂交瘤细胞能够稳定分泌环孢素A单克隆抗体。 结论:该实验方法能够有效的合成环孢素A完全抗原;合成抗原能够刺激BALB/C小鼠机体产生免疫应答反应并产生相应环孢素A抗体;实验所采用杂交瘤技术能够成功的制备环孢素A单克隆抗体。
【图文】：

3.3.2 酶联免疫吸附法鉴定 CsA 完全抗原酶联免疫吸附法鉴定原理：酶联免疫吸附法（ELISA）是一种以免疫反应为基础，将抗原与抗体的特异性反应同酶对底物的高效催化作用相结合的实验技术[25]。酶的高效催化作用，能够放大反应结果，从而使测定方法达到很高的敏感度[26]。酶联免疫吸附法的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。①抗原或抗体与固相载体聚苯乙烯表面的疏水性部分相互吸附而结合于固相载体表面，，并保持其免疫学活性；②抗原或抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物，并保持其免疫学活性和酶学活性；③酶结合物与相应抗原或抗体结合后，加入酶催化底物，底物被酶催化变为有色产物，根据颜色变化判断是否存在免疫反应，进行定性分析。另外，颜色反应的深浅与相应被检抗原或抗体的量成正相关，据此对被检物进行定量分析。④酶联免疫吸附法每加入一种试剂温育后，通过洗涤去除残留游离反应物，避免残留物对实验结果的影响，从而保证结果的准确性。主要的反应过程见下图 1。

图 2 抗原抗体比例与生成沉淀物量的关系最佳包被比例确定具体操作步骤：标板，第二孔加包被液 200μ l，其它各孔中为 100μl。 10μl 于第二孔中，然后依次倍比稀释，终体积为 100μ l/孔置过夜。弃去孔内液体，用 ELISA 洗涤液洗板 7 次，扣干。 BSA100μl/孔，薄膜封好，37℃ 水浴锅中温育，水浴锅中 处为宜。弃去孔内液体，按照上述同样的方法洗板。加美国雅培公试剂盒中的 CsA 单克隆抗体 100μl /孔（ELISA 洗涤液 1浴温育。去孔内液体，洗板，扣干。每孔加 HRP 标记羊抗鼠 IgG 抗：500 稀释） 100μl，37℃ 水浴温育。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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