内源性SelS在恒定及波动高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的机制探讨

发布时间：2019-11-25 09:10

【摘要】： 目的：原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用第2代细胞进行实验。以20mM的右旋葡萄糖(D-glucose)分别处理细胞24h和7d,观察各不同处理组细胞的氧化应激指标及窖蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1)、蛋白激酶Cα(PKCα)、硒蛋白S(SelS)在1nRNA和蛋白水平表达的差异,研究高糖对HUVEC的损伤作用是否通过PKC通路发挥作用,及此通路与Cav-1、SelS的关系,为研究内皮保护策略提供新的实验依据。 方法： 1. HUVEC的原代培养及鉴定。 2.细胞分别在含D-glucose为5.5mM(正常组)、10mM(HG10组)、20mM(HG20组)、30mM(HG30组)的培养液及含5.5mM D-glucose和14.5mM甘露醇(甘露醇组)的培养液中干预24h和48h后,用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度D-glucose对细胞增殖能力的影响；取各组细胞上清液,用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)的活力。 3.依据MTT结果,以HG20组作为高糖组,以甘露醇组作为渗透压对照,与正常组共同处理24小时后提取各组细胞总RNA及总蛋白。采用实时定量PCR方法检测各组细胞Cav-1、SelS及PKCa在mRNA水平的表达差异：Western blot方法检测Cav-1、SelS及PKCa在蛋白水平的表达差异。 4.以含5.5mM和20mM的D-glucose隔日波动干预为波动组,与高糖组、正常组及甘露醇组共同处理7天后提取各组细胞总RNA及总蛋白,采用实时定量PCR的方法检测各组细胞Cav-1、SelS及PKCa在mRNA水平的表达；Western blot的方法检测Cav-1、SelS及PKCa在蛋白水平的表达差异。 结果： 1.成功培养了原代HUVEC,经鉴定第2代细胞HUVEC的阳性率为98.46。 2.细胞生存率(%)：处理24h后,HG20组及HG30组细胞生存率与正常组相比明显下降(P0.01),分别为71±1.5、60±0.5和93±1.5；不同条件培养48h后,HG20组及HG30组细胞生存率与正常组相比进一步降低(P0.01),分别为65±2.0、53±1.5及92±3.0。处理24h和48h,HG10组、甘露醇组细胞生存率与正常组相比均差异(P0.05),分别为89±1.5、91±1.2、93±1.5以及85±2.6、88±2.9、92±3.0。 3.MDA含量(nmol／ml)：各组细胞上清中MDA含量随葡萄糖浓度的升高而增加。处理24h后,HG20组及HG30组细胞上清MDA含量与正常组相比明显著升高(P0.01),分别为6.28±0.29、11.28±0.40及0.93±0.66；处理48h后,HG20组及HG30组细胞上清MDA含量进一步升高(P0.01),分别为8.99±0.19和15.93±0.57。无论是处理24h还是处理48h,HG10组、甘露醇组与正常组细胞上清中MDA含量相比均无差异(P0.05),分别为1.17±0.21、1.03±0.46、0.93±0.66以及1.22±0.33、1.07±0.21、0.97±0.36。 4.SOD活力(U／ml)：各组细胞上清液中SOD的活力随着葡萄糖浓度的升高而减弱。处理24h后,HG20组及HG30组细胞上清SOD活力与正常组相比显著减弱(P0.01),分别为6.82±0.23、5.70±0.22及8.62±0.09。处理48h后,HG20组及HG30组细胞上清SOD活力进一步减弱(P0.01),分别为6.044±0.16和5.08±0.87。处理24h和48h后,HG10组、甘露醇组细胞上清中SOD活力与正常组相比均无差异(P0.05),分别为：8.10±0.80、8.32±2.33、8.62±0.09及7.74±0.12、7.80±1.58、8.23±0.46。 5.Cav-1的表达：处理24h和7d后,高糖组Cav-1 mRNA表达与正常组相比明显升高(P0.01),分别为1.12±0.21、0.76±0.04及1.48±0.35、0.74±0.13；波动组进一步升高,为2.16±0.02,且波动组Cav-1 mRNA表达亦高于高糖组(P0.01)；无论是24h还是7d,甘露醇组Cav-1 mRNA表达与正常组相比无差异(P0.05),分别为0.79±0.05、0.76±0.04及0.75±0.02、0.74±0.13。同样的,处理24h和7d后高糖组Cav-1在蛋白水平的表达与正常组相比明显升高(P0.05)(P0.01),分别为1.62±0.07、1.21±0.01及0.69±0.02、0.32±0.01。波动组Cav-1蛋白的表达进一步升高,为1.14±0.02,且波动组Cav-1蛋白表达水平亦高于高糖组(P0.01)；无论处理24h还是7d,甘露醇组Cav-1蛋白表达水平与正常组相比无差异(P0.05),分别为1.21±0.02、1.21±0.01及0.34±0.02、0.32±0.01。 6. SelS的表达：不同条件处理24h及7d后,高糖组SelS mRNA表达水平与正常组相比无差异(P0.05),分别为：1.32±0.12、1.28±0.03、及1.33±0.01、1.27±0.02；处理7d后,波动组SelS mRNA表达与高糖组及正常组相比无差异(P0.05),为1.33±0.01；无论处理24h还是7d,甘露醇组与正常组SelS mRNA表达水平相比无统计学意义(P0.05),分别为1.27±0.08及1.31±0.01。同样的,处理24h和7d后,SelS蛋白的表达水平在正常糖组及高糖组分别为：0.38±0.02、0.43±0.08及0.68±0.04、0.69±0.04,均无统计学意义(P0.05)。处理7d后,波动组SelS蛋白表达与高糖组及正常组相比无差异(P0.05),为0.70±0.01；无论处理24h还是处理7d,甘露醇组SelS的蛋白表达水平与正常组相比均无统计学意义(P0.05),为0.42±0.02和0.69±0.01。 7.PKCα的表达：不同浓度葡萄糖处理24h及7天后,高糖组PKCαmRNA表达水平与正常组相比无差异(P0.05)分别为：1.38±0.14、1.36±0.33和1.38±0.28、1.35±0.46；处理7d后,波动组PKCa mRNA表达水平与高糖组及正常组相比均无差异(P0.05),为1.39±0.03；无论处理24h还是7d,甘露醇组与正常组PKCa mRNA表达水平均无统计学意义(P0.05),为1.40±0.06和1.42±0.01。同样的,不同处理24h及7d后,高糖组PKCa蛋白表达水平与正常组相比无差异(P0.05),分别为：0.83±0.02、0.84±0.02及1.03±0.02、0.98±0.04；处理7d后,波动组PKCa蛋白表达水平与高糖组及正常组相比亦无差异(P0.05)为：0.99±0.02；无论处理24h还是7d,PKCa蛋白表达水平在甘露醇组与正常组之间均无统计学意义(P0.05),分别为0.82±0.02和0.96±0.03。 结论： 1.高糖对内皮细胞的生长有抑制作用,高糖损伤后细胞MDA的生成增加,SOD活力降低,具有降低内皮细胞生存率的作用。 2.恒定高糖及波动高糖对内皮细胞的损伤可能与Cav-1相关,而不同浓度葡萄糖及波动高糖处理后PKCα和SelS的表达无论在mRNA水平还是蛋白水平均无差异。
【图文】：

注:A:B:图4流式细胞术鉴定HUVEC第一代HuVEC阴性对照(阴性率为0.96%)第一代样品阳性率(阳性率为90.33%)第二代阴性对照(阴性率为0.82%)第二代样品阳性率(阳性率为98.46%)DC

各组Cav一1实时定量PCR扩增曲线
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【共引文献】

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本文编号：2565649