抗白念珠菌天然单链抗体库的构建、筛选及初步鉴定

发布时间：2019-11-27 05:24

【摘要】： 目的: 利用基因工程方法和噬菌体抗体库技术构建人源性白念珠菌单链抗体文库,并从中筛选出特异性的噬菌体单链抗体,为白念珠菌感染的免疫诊断及免疫治疗提供新的方法和手段。 方法: 1 ScFv的连接:取白念珠菌恢复期病人外周血淋巴细胞(PBMC)作为B细胞的来源,提取总RNA,反转录为cDNA,通过降落PCR的方法分别扩增抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)基因片段。以V_H和V_L基因为模板分别扩增V_H-linker和V_L-linker,然后利用SOE-PCR将他们拼接成完整的单链抗体(ScFv)基因。最后,在单链抗体基因片段的两端引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。 2 ScFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E的拼接及抗体库的构建:单链抗体基因片段与噬菌粒载体pCANTAB-5E各自经SfiⅠ和NotⅠ酶切,连接成重组噬菌体,并转染感受态大肠杆菌XL1-Blue中表达,经辅助噬菌体(helper phage)VCSM13扩增后,构建出初级的噬菌体抗体库。 3噬菌体抗体库的富集筛选:利用白念珠菌标准株与临床分离株对抗体库进行负正筛选,共进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,使抗体库得到有效富集。 4噬菌体ScFv的ELISA鉴定:对第五轮筛选后的阳性克隆的亲和性分别用白念珠菌标准株、临床分离株和大肠杆菌进行ELISA鉴定。 结果: 1从人淋巴细胞中提取的总RNA在1.5%琼脂糖凝胶电泳结果中可见明显的28s、18s和5s条带;V_H基因片段的大小约为340bp,V_L基因片段的大小约为300bp;组装以后的ScFv基因片段约为700bp。 2单链抗体基因片段和pCANTAB-5E分别经SfiⅠ和NotⅠ双酶切后,转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,结果获得4.5×10~7cfu/μg氨苄青霉素抗性克隆。随机酶切反应鉴定阳性插入率为83.3%(20/24)。质粒PCR与测序结果证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确的插入载体。 3经过5轮白念珠菌“吸附-洗脱-扩增”的负正性筛选,得到一个4.5×10~7的噬菌体抗体库,说明特异性的ScFv得到了有效富集。 4对第五轮筛选后得到的噬菌体抗体进行ELISA检测,结果显示:3/9的克隆呈阳性反应。 结论: 利用噬菌体抗体库技术,构建了库容量为4.5×10~7的白念珠菌相关人源单链抗体库,并利用白念珠菌临床分离株进行初步筛选。通过ELISA鉴定,获得的噬菌体抗体克隆具有特异性,为白念珠菌感染的临床检测、药物治疗及耐药性的研究提供了理论依据。
【图文】：

抗体库的多样性表达Fig3ExPressthediversityofantibo勿library

抗体筛选示意图
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 赵敬军;;白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的研究近况[J];国外医学(微生物学分册);2000年02期

2 吴惠兰;;噬菌体展示技术及其在药物开发中的应用[J];海峡药学;2006年04期

3 王天云,张贵星,薛乐勋;一种简便高效的改良降落PCR[J];中国生物工程杂志;2003年11期

4 赵云峰,王海涛,王全立,杜芝燕,杨景庚,孙红琰,马立人,殷震;噬菌体抗体文库的构建及人源抗HIV-1 gp 160抗体的筛选[J];中国生物化学与分子生物学报;1998年01期

5 洪龙,杨柏成,朱圣庚;轮换淘选法筛选凝血酶特异的噬菌体抗体[J];微生物学通报;2005年03期

6 王明桥;罗文新;陈瑛炜;袁权;王晋;张军;夏宁邵;;噬菌体抗体库固相筛选条件的初步研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年05期

7 万兵,闫杰,季明春,张利宁,申厚凤,陈志琳;一种优化的PCR方法——降落PCR扩增目的基因[J];江苏临床医学杂志;2002年02期

8 唐晓明;杨俊涛;王清明;汪思应;;新式SOE PCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用[J];安徽医科大学学报;2006年01期

9 荚卫东;孙惠川;薛琼;钱永兵;刘银坤;汤钊猷;;利用噬菌体肽库筛选高转移潜能人肝癌细胞结合肽[J];中华实验外科杂志;2006年03期

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本文编号：2566473