【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)常引起持续性感染,导致慢性肝炎,并引起肝硬化和肝细胞癌。HBV感染引起慢性化的机制尚不清楚,但病毒编码的蛋白对机体免疫应答的调节作用是其中之一,随着固有免疫应答的深入研究,HBV对固有免疫的调节作用也日益受到重视,同时通过诱导固有免疫应答有望在慢性HBV的治疗中发挥一定的作用。 固有性免疫(innate immunity)应答是机体快速抵抗微生物病原体的重要机制。表达于免疫细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),启动一系列信号转导途径,诱导保护性细胞因子如Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)和前炎症细胞因子的表达,发挥抗病毒固有免疫作用,并调节适应性免疫(adaptive immunity)应答。以Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)为代表的PRR是抗病毒固有免疫的关键性识别结构,TLR3,TLR7,TLR8和TLR9主要与病毒的识别有关,如TLR3识别病毒双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)类似物聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(polyinosinic-poly cytosine nucleotide,polyⅠ:C)。TLRs与特异性配体结合后,通过MyD88依赖性和TRIF依赖性途径,激活NF-κB和干扰素调节因子3(interferonregulatory factor3,IRF3),诱导抗病毒免疫分子的表达。此外,胞浆内的PRR如视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)和黑素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)等也能识别病毒PAMP如dsRNA,诱导IFN-β的表达。在TLRs和RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)介导的固有免疫应答信号通路中均能激活TANK结合激酶1(TANK-bindingkinase-1,TBK1),表明其在机体固有免疫应答中起着至关重要的作用。通过激活TBK1,活化的TBK1能诱导IRF3二聚化并转入核内,从而增强Ⅰ型干扰素的表达,调节机体的固有免疫应答,并影响适应性免疫,有可能在慢性病毒感染如HBV和HCV感染的治疗中发挥一定的作用。 目的: 本研究以肝癌细胞株HepG2和整合HBV的肝癌细胞株HepG2.2.15为细胞模型,研究dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的信号转导特点;HBcAg真核表达质粒体外转染及其重组蛋白处理HepG2细胞,观察HBcAg对dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用;TBK1真核表达质粒体外转染HepG2细胞和HepG2.2.15细胞,观察TBK1的抗HBV作用。本研究以期为阐明肝细胞内抗病毒免疫机制和HBV慢性感染的分子机制,同时也为研制新型慢性乙肝治疗药物提供实验和理论依据。 方法: 1.HBcAg对dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用: 1.1 pcDNA3-HBc质粒的构建:以HBV ayw亚型全长质粒pCP10为模板,PCR扩增编码HBcAg的基因,将其插入真核表达质粒载体pcDNA3。 1.2 polyⅠ:C刺激HepG2细胞诱导IFN-β的表达:取对数生长期HepG2细胞,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激细胞12h、24h,刺激后提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-βmRNA表达。 1.3 pcDNA3-HBc转染HepG2细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:取对数生长期HepG2细胞,将质粒pcDNA3-HBc以1.2μg转染细胞,培养24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激细胞24h,定量PCR检测IFN-βmRNA表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度。 1.4 HBcAg重组蛋白对polyⅠ:C诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用:取对数生长期HepG2细胞,HBcAg重组蛋白以0μg/ml、10μg/ml处理细胞48h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激细胞24h。定量PCR检测IFN-βmRNA表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度。 2 TBK1对dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用: 2.1 pcDNA3-hTBK1质粒的构建:以hTBK1 DNA为模板,PCR扩增目的基因,将其插入真核表达质粒载体pcDNA3。 2.2 pcDNA3-hTBK1转染Hela细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:取对数生长期Hela细胞,将质粒pcDNA3-hTBK1以0μg、0.6μg、1.2μg、1.8μg转染细胞,培养24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激细胞24h,定量PCR检测IFN-βmRNA表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度。 2.3 pcDNA3-hTBK1转染HepG2细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:取对数生长期HepG2细胞,将质粒pcDNA3-hTBK1以不同浓度转染细胞,培养24h后,100μg/ml polyⅠ:C刺激细胞24h,定量PCR检测IFN-βmRNA表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度。 2.4 polyⅠ:C刺激HepG2.2.15细胞诱导IFN-β的表达:取对数生长期HepG2.2.15细胞,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激细胞24h,定量PCR检测IFN-β的表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度;时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测细胞上清中HBsAg和HBeAg含量;定量PCR检测细胞上清和细胞中HBV DNA拷贝数。 2.5 pcDNA3-hTBK1转染HepG2.2.15细胞对polyⅠ:C诱导抗病毒作用的调节作用:取对数生长期HepG2.2.15细胞,将质粒pcDNA3-hTBK1以1.8μg转染细胞,培养24h后,polyⅠ:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激细胞24h,定量PCR检测IFN-βmRNA表达;ELISA检测细胞上清中IFN-β浓度;同时检测细胞上清中HBsAg和HBeAg含量及上清和细胞中HBV DNA拷贝数。 结果: 1.HBcAg对dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用: 1.1经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳鉴定,以及重组体插入片段的DNA序列测定,证实成功地构建了含C基因的真核表达质粒pcDNA3-HBc。 1.2 polyⅠ:C刺激HepG2细胞诱导IFN-β表达:polyⅠ:C刺激细胞12h,与对照组相比,刺激组IFN-β表达显著增高(P＜0.05),并随浓度增高而表达升高,各刺激组有显著差异(P＜0.05),同时polyⅠ:C刺激细胞24h较刺激12h组IFN-β表达显著增高(P＜0.05)。 1.3 pcDNA3-HBc转染HepG2细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:与对照组相比,1.2μg转染组IFN-β表达有所降低,但无统计学差异(P＞0.05);与对照组相比,细胞上清中IFN-β浓度显著减少(P＜0.05)。 1.4 HBcAg重组蛋白对polyⅠ:C诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用:与对照组相比,HBcAg重组蛋白处理组IFN-β表达和浓度均显著降低(P＜0.05)。 2.TBK1对dsRNA诱导肝细胞表达IFN-β的调节作用: 2.1经XbaⅠ和BamHⅠ酶切电泳鉴定,以及重组体插入片段的DNA序列测定,证实成功地构建了含hTBK1的真核表达质粒pcDNA3-hTBK1。 2.2 pcDNA3-hTBK1转染Hela细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:与对照组和其他转染组相比,1.8μg转染组IFN-β表达显著增加;与对照组和0.6μg转染组相比,1.2μg转染组IFN-β表达也显著增加(P＜0.05);与对照组相比,各转染组IFN-β浓度均有增加,但无统计学差异(P＞0.05)。 2.3 pcDNA3-hTBK1转染HepG2细胞对polyⅠ:C诱导表达IFN-β的作用:随着转染量的增加,IFN-β表达显著增加,与对照组和0.6μg转染组相比,1.2μg、1.8μg转染组IFN-β表达显著增加,不同浓度转染组有显著差异(P＜0.05);与对照组相比,各转染组细胞上清IFN-β浓度均无显著差异(P＞0.05)。 2.4 polyⅠ:C刺激HepG2.2.15细胞诱导IFN-β的表达:与对照组相比,不同浓度刺激组IFN-β表达无显著差异(P＞0.05)。随着polyⅠ:C刺激浓度的增加,上清中IFN-β浓度呈梯度显著增加,不同浓度刺激组也存在显著差异(P＜0.05)。与对照组相比,不同浓度刺激组上清中HBsAg和HBeAg含量、及上清和细胞中HBV DNA拷贝数均无显著差异(P＞0.05)。 2.5 pcDNA3-hTBK1转染HepG2.2.15细胞对polyⅠ:C诱导抗病毒作用的调节作用:与对照组和25μg/ml刺激组相比,100μg/ml polyⅠ:C刺激组IFN-β表达显著增加(P＜0.05);与对照组相比,各刺激组上清中IFN-β浓度均无显著差异(P＞0.05)。与对照组相比,50μg/ml和100μg/ml polyⅠ:C刺激组HBsAg表达显著降低(P＜0.05),不同浓度刺激组HBeAg表达无显著差异(P＞0.05);与对照组相比,不同浓度刺激组上清HBV DNA拷贝数均有显著下降(P＜0.05),各组则无显著差异(P＞0.05);不同浓度刺激组细胞HBV DNA拷贝数无显著差异(P＞0.05)。 结论: polyⅠ:C刺激HepG2和HepG2.2.15细胞可诱导IFN-β表达,提示肝细胞可能在抗病毒固有性免疫应答中起重要的作用。HBcAg真核表达质粒体外转染及其重组蛋白处理可抑制polyⅠ:C诱导HepG2细胞表达IFN-β,提示HBcAg具有拮抗机体抗病毒固有免疫的作用。hTBK1真核表达质粒转染HepG2细胞和HepG2.2.15细胞,可促进polyⅠ:C诱导HepG2细胞和HepG2.2.15细胞表达IFN-β,同时一定浓度的hTBK1转染可有效降低HepG2.2.15细胞分泌HBsAg及HBV DNA拷贝数,提示TBK1可能通过增强固有免疫信号转导途径,增加细胞因子如Ⅰ型干扰素(IFN-β)的表达,进而对HBV起到一定抑制作用。结果提示,病毒感染时肝细胞可产生一定的固有免疫应答,发挥抗病毒作用,而HBV可通过表达病毒蛋白HBcAg拮抗机体的抗病毒固有免疫应答,同时促进TBK1的表达和激活能提高肝细胞的固有免疫应答。研究结果有助于了解肝细胞在抗HBV感染固有免疫应答中的作用以及HBV慢性感染的分子机制,同时也为研制新的慢性乙肝治疗药物提供新的思路和策略。
【图文】：
图1.1HBcAgPcR产物电泳结果Fig.1.1ElectroPhoretieanalysisofHBcAgPCRProduetLanel，2:HBcAgPCRProduet图1.2peDNA3一HBc酶切产物Fig.1.2EleetroPhoretieanrestrietionenz犯nediPeDNA3一HBe
实验结果1HBcAg对dsRNA诱导肝细胞表达IFN一p的调节作用1.1penNA3一HBc质粒的构建以HBvayw亚型全长质粒pcP10为模板，PcR扩增编码HBcAg的基脂糖凝胶电泳可见约55lbp的目的基因片段，见图1.1。采用EcoRI和Bam步酶切筛选重组peDNA3一HBc质粒阳性克隆，琼脂糖凝胶电泳可见一条约目的片段和约5.4kb的载体片段，与预期结果相符。筛选的阳性克隆经上DNA序列测定，结果与HBVayw亚型核心抗原基因DNA序列完全一致，组pcDNA3一HBc质粒构建成功，见图1.2和图1.3。bPl2b
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392
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