Rac1与骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程关系的研究

发布时间：2019-12-06 09:11

【摘要】： 目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓中除造血干细胞外另一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。在不同的条件下可以诱导分化为成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞及神经细胞等。另外,骨髓间充质干细胞具有取材方便,对机体损伤小,体外培养增殖能力强等优点,选用自体骨髓间充质干细胞进行组织再生或移植,不仅没有移植排异反应,还避免了伦理纷争。因此骨髓间充质干细胞被认为是最有前途的组织工程种子细胞。诱导骨髓间充质干细胞向神经系统组成细胞分化是目前研究的热点,而BMSCs的准确诱导定向分化是其用于临床治疗的基础,这就需要对BMSCs有关的信号调节、微环境作用进行深入研究。目前研究发现BMSCs向神经样细胞诱导分化大致上可分为四种途径:细胞生长因子为基础的诱导、提高胞内cAMP为基础的方式诱导、抗氧化剂为基础的诱导、神经细胞培养上清液为基础的诱导。 Rac1是小G蛋白Rho家族的成员之一,在细胞中以有活性的GTP形式与无活性的GDP形式存在,参与细胞骨架重组、基因转录调控和细胞信号转导等生理过程,影响细胞的极性与形态、粘附与迁移、增殖与分化等细胞事件。研究证实,在神经细胞发育过程中Rac1、Cdc42、RhoA参与了轴突与树突的形成。本实验以BMSCs向神经样细胞分化过程中Rac1蛋白及其活性形式表达变化为研究内容,旨在探讨Rac1与BMSCs向神经样细胞分化过程的关系。方法采用Percoll法分离大鼠骨髓间充质干细胞、通过传代得到纯化的BMSCs,并对细胞进行表型检测及成骨、成脂肪分化能力鉴定。取第5代的骨髓间充质干细胞,分别应用丁羟基茴香醚(BHA)、碱性成纤维生长因子(bFGF)联合诱导剂和全反式维甲酸(RA)、β-巯基乙醇(β-ME)联合诱导剂诱导细胞。对诱导细胞进行形态观察和免疫荧光染色检测神经细胞标志物。综合比较两种诱导方法的效果,从中选择最适合的一种作为研究Rac1与BMSCs向神经样细胞过程关系的实验方法。根据BMSCs向神经样细胞分化过程的特点,设立A-J十个实验检测点:细胞接种后24 h达到50%汇合为A点,接种后换成含bFGF的预诱导液培养24 h为B点,预诱导后换成含BHA的诱导剂诱导5 h为C点,诱导后用含N2的神经细胞维持培养基培养18 h为D点、维持培养长达48 h为E点,预诱导24 h后换回BMSCs常规培养基返回培养24 h为F点,诱导5 h后换回BMSCs常规培养基返回培养18 h为G点、返回培养后再次预诱导24 h为H点、再次诱导5 h为I点,用神经细胞维持培养基维持培养18 h后换回BMSCs常规培养基培养24 h为J点。采用免疫荧光染色检测相关细胞表型在实验过程中的表达情况,免疫印迹(Western blot)结合免疫沉降(Pull-down)的方法测定各实验检测点Rac1、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表达变化情况。结果免疫荧光染色检测显示体外培养的细胞表达间质细胞表面抗原CD29、CD90、CD106、CD71,而不表达造血细胞特异性抗原CD34、CD45,证明了所培养的细胞是BMSCs。组织化学染色显示BMSCs成骨、成脂肪诱导分化的细胞分别呈现碱性磷酸酶染色阳性和油红O染色阳性,进一步鉴定了用于实验的细胞是具有多向分化潜能的BMSCs。对BMSCs向神经样细胞分化过程中神经细胞标志物的免疫荧光染色检测结果显示,BHA、bFGF联合诱导剂和RA、β-ME联合诱导剂均能诱导BMSCs分化为表达神经细胞标志物nestin、β-tubulin和成熟神经元标志物NSE的神经样细胞,而两种方法分化的细胞均不表达星形胶质细胞标志物GFAP,BHA、bFGF联合诱导组和RA、β-ME联合诱导组诱导的细胞表达成熟神经元NSE的阳性率分别为80.05%和71.61%,两者相比无统计学差异。采用BHA、bFGF联合诱导剂诱导BMSCs向神经样细胞分化过程中,诱导5 h后细胞的Rac1蛋白表达水平与诱导前相比显著降低,诱导后用神经细胞维持培养基培养18 h、维持培养48 h与诱导前相比也显著下降。诱导5 h的细胞用BMSCs常规培养基培养后,细胞返回BMSCs的形态,且Rac1蛋白表达水平比诱导后的细胞显著上升,对该返回BMSCs形态的细胞再次诱导,Rac1蛋白表达水平仍然表现出诱导后比诱导前显著下降的情况。然而,我们对诱导后的细胞用神经细胞维持培养基培养18 h后再换回BMSCs常规培养基培养,细胞不能返回BMSCs的形态,且Rac1蛋白表达仍然维持在一个较低的水平。BMSCs向神经样细胞分化过程中,Cdc42、RhoA的蛋白表达变化趋势与Rac1一致。蛋白活性检测显示Rac1-GTP活性蛋白表达在BMSCs向神经样细胞分化过程中上升,Cdc42-GTP活性蛋白与Rac1-GTP变化一致,而RhoA-GTP则下降。免疫印迹实验结果显示,Rac1、Cdc42、RhoA蛋白表达水平在BMSCs向神经样细胞分化过程中显著降低;Rac1、Cdc42活性蛋白含量上升,而RhoA活性蛋白含量下降。结论骨髓间充质干细胞可在体外分离培养并稳定扩增传代至30代而未发生老化。BMSCs能够定向分化成骨、脂肪细胞及具有神经细胞表型的神经样细胞。Rac1及其相关蛋白Cdc42、RhoA的蛋白表达及活性与BMSCs向神经样细胞分化过程相关,为调控BMSCs定向分化为神经系统组成细胞提供了一定的实验依据。
【图文】：

相差显微镜,细胞形态,免疫荧光染色,细胞

21图 1-1 相差显微镜观察各代细胞形态。（A）原代培养培养 3-4 天，贴壁细胞变为长梭形，聚集成团，形成克隆；（B）原代培养 10 天后细胞接近汇合，呈长梭形排列，并汇合成漩涡状；（C）10 代细胞保持长梭形形态生长；（D）30 代细胞保持成纤维细胞样形态呈漩涡状生长。Scale bar=100μm。2 免疫荧光染色鉴定细胞表型免疫荧光染色结果显示：所测细胞呈现 CD29、71、90、106 表面抗原阳性（图1-2），而造血细胞特异抗原 CD34、CD45 阴性（图中未示）。

脂滴,细胞,浅棕色,脂肪

图 1-2 BMSCs 的表型鉴定。（A、B）CD90 阳性；（C、D）CD29 阳性；（E、F）CD106 阳性；（G、H）CD71 阳性。Scale bar=50 μm。3 成骨、成脂肪分化能力鉴定成骨诱导后细胞长至汇合，由长梭形变为多角形，并且呈现铺路卵石样排列（图1-3A），随着诱导时间的延长，局部细胞呈重叠生长，基质逐渐堆积、基质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。碱性磷酸酶染色显示成骨诱导 21 天时多数细胞呈阳性反应，即胞浆中出现浅棕色至棕黑色的细胞颗粒，，可见到被染成深棕黑的融合成片状的阳性细胞（图 1-3B）。非诱导对照组经钙钴法染色后，大部分细胞呈现伊红复染后的粉红色，偶见少数细胞呈现浅棕色，细胞仍呈长梭形生长，未见片状强阳性细胞（结果未示）。成脂肪诱导 6 天，部分细胞胞质内出现散在小脂滴，主要分布细胞核周围。随着培养时间延长，出现脂滴的细胞增多，培养 9 天时可见细胞质内充满大小均一的脂滴。继续诱导后，可见胞质内的脂滴逐渐融合成大脂滴，细胞体积增大，
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

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