BAFF及其受体融合蛋白的构建表达纯化与功能鉴定

发布时间：2019-12-06 12:19

【摘要】： B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF),又称为B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是TNF家族成员之一。它可特异性的刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体,对B细胞的存活、发育、分化起到重要的调控作用。BAFF可与三种受体:BCMA、TACI和BAFF-R结合,通过激活NF-κB信号转导途径增强B细胞的抗凋亡能力。BAFF的过表达与系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及干燥综合征(SS)等许多自身免疫性疾病及B细胞肿瘤的发生和发展有着密切关系。由于受体与BAFF具有高亲和力,可特异性识别BAFF并与之结合,因此体外构建表达的BAFF受体胞外段融合蛋白可中和体内过表达的BAFF,控制B细胞的增殖和活化,缓解和治疗与BAFF相关的自身免疫病和B细胞肿瘤。本课题的研究为开发BAFF拮抗剂治疗BAFF相关疾病提供了实验基础。本课题研究方法:对BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体进行鉴定,表达受体和配体蛋白并对其进行纯化,在体外研究受体与配体相互作用,并在细胞水平鉴定受体中和配体功能的活性。主要研究结果: (一)BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体的鉴定:本实验室已将钓取的BAFF及其受体基因片段连接到原核表达载体pET-32a或pGEX6p-1上,对重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序鉴定,证明表达载体构建正确。 (二)BAFF及其受体融合蛋白的表达与纯化:重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)、JM109等。在IPTG诱导下,使基因在工程菌中表达,经SDS-PAGE鉴定。融合蛋白分别利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱和谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液纯化,经浓缩和浓度测定后分装冻干保存。 (三)BAFF受体融合蛋白的活性鉴定:首先通过酶联免疫吸附法检测了BAFF与受体融合蛋白在体外结合情况。然后在体外建立的BAFF刺激小鼠脾细胞增殖模型中,观察到融合蛋白对BAFF的活性有一定得拮抗作用,并呈现时间和剂量依赖性。
【图文】：

受体,配体

第一章文献综述1.2 BAFF 受体1.2.1 概述BAFF 可与三种受体[20]：B 细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA[21]，跨膜激活物和 CAML 结合物(Transmembrane activator and CAML-interactoTACI)[22]和 BAFF 受体（BAFF receptor, BAFF-R）[23]结合。三个受体均含有与配体相结合的半胱氨酸富集区，但不含死亡区域的功能区，，因而与 BAFF 结合后不能诱导细胞凋亡，而可通过激活 NF-κ B 促进细胞生长、分化和成熟[24]。其中 BR3 只特异于 BAFF 结合，是三个受体中亲和力最强的一个[25,26]。BCMA 和 TACI 不仅能与 BAFF 相结合，也能够与 TNF 配体家族的另一个成员增殖诱导配体 APRIL (a proliferation-inducing)相结合。APRIL 对淋巴、结肠及甲状腺系统的肿瘤细胞有刺激其生长的作用[27]。

载体,表达载体

定载体是否进入细胞；可控转录启动子，经诱导后从克隆化基NA；转录调控序列；一个多限制酶位点接头，以便外缘基因验室已将从Daudi细胞系cDNA文库中克隆的BAFF及其受体2a、pGEX6p-1 等原核表达载体中，构建成为重组元和表达载体基础上对重组表达载体进行了 PCR、酶切和测序鉴定，以证确。与仪器料宿主菌：oli. JM109；E. Coli. BL21；E. Coli. Rosetta（DE3）载体：32a：
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【引证文献】