小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的分离培养、纯化和鉴定

发布时间：2020-01-22 21:43

【摘要】：目的：树突状细胞（dendritic cell，DC）是迄今发现惟一能刺激初始T细胞活化增殖的抗原递呈细胞（antigen presenting cell,APC），也是体内最主要的抗原递呈细胞。既往认为DC是特异性免疫应答的启动者，但近年来研究发现DC在免疫调节中发挥免疫应答和免疫耐受的双重作用。根据成熟程度，将DC分为未成熟DC（immature DC,imDC)和成熟DC（matureDC,mDC)。mDC可以激活T淋巴细胞诱导免疫应答，而imDC不能活化T淋巴细胞，但具有较强的抗原摄取及处理能力。最近的研究表明imDC可诱导免疫耐受，其机制有清除T细胞、诱导T细胞免疫无能和诱导调节性T细胞的产生。基于imDC的特性，近年来将imDC用于T细胞介导的自身免疫性疾病的研究越来越得到重视。因此，能够准确、高效的分离培养出imDC并对其进行鉴定是运用imDC开展下游实验的前提与基础。本研究旨在用rmGM-CSF、rmIL-4体外诱生小鼠骨髓源未成熟树突状细胞，并运用免疫磁珠分离的方法纯化所获得的imDC，并从形态学、细胞表面分子的表达及对同种异基因T细胞的刺激增值能力三个方面对imDC进行鉴定，对小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的体外分离培养、纯化和鉴定方法进行探讨和改良。方法: 1小鼠骨髓源性未成熟DC的体外诱导及培养用拉颈法处死C57/B6小鼠，用75%乙醇与碘伏消毒后，无菌条件下取出下肢骨并去除周围组织，在长骨两端打孔使骨髓腔联通并暴露骨髓，用适量RPMI-1640培养液冲出骨髓，使用200目滤网过滤杂质并收集细胞后加入红细胞裂解液。裂解红细胞完毕后用RPMI-1640培养液洗涤细胞，然后用细胞培养液（含10%胎牛血清、RPMI-1640、rmGM-CSF（10ng/ml）、rmIL-4(10ng/ml)）调整细胞浓度到10~6/ml。6孔培养板中每孔加入4ml上述液体，将培养板放入37oC、含5%CO_2的培养箱中培养，于第48小时更换培养液，于第96小时补充培养液，至第5天收集所有悬浮细胞，用所得细胞进行下一步实验。 2分离纯化imDC 计数后将imDC重悬于缓冲液中并加入CD11c免疫磁珠，于4oC冰箱内孵育15分钟后重悬。利用磁珠分选器分选，将磁珠标记的细胞悬液置入分选柱中，收集流出物，此为未标记的阴性细胞。然后收集分选柱中的CD11c+细胞，此即为纯化后的imDC。 3小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的鉴定 3.1细胞形态学观察在倒置荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜下对imDC进行观察。 3.2流式细胞术检测细胞表面分子将培养板中的悬浮细胞收集至离心管中，做流式细胞检测前处理并加入抗体孵育。检测imDC表面MHC-II、CD11c、CD80、CD86分子的表达情况。 3.3采用细胞增殖检测试剂法（CCK-8法）检测imDC对同种异基因T细胞刺激增殖能力 3.3.1取BALB/c小鼠脾脏中的T细胞作为反应细胞，并取部分细胞做分选前流式检验。 3.3.2取C57/B6小鼠骨髓中的imDC作为刺激细胞，方法同前。 3.3.3用免疫磁珠法分离并纯化小鼠脾脏T细胞并用流式细胞技术检测纯化后的细胞纯度。 3.3.4imDC与T细胞的单向混合淋巴反应（one-way mixed lymphocytereaction，，MLR）：设定imDC:T细胞比例为1:5、1:10、1:20、1:40，在96孔板中接种细胞并连续培养72小时，于培养结束前4小时加入CCK-8，在加入CCK-8后的第2、3、4小时分别使用酶联检测仪检测一次并记录吸光度值。结果: 1未成熟DC生长情况小鼠骨髓源细胞经rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养48小时后可见大部分细胞贴壁生长，细胞形态大小不等。于培养72小时后悬浮细胞较前增多，并出现几个细胞聚集成团的现象。第5天时悬浮细胞的体积变大数量明显增多，细胞的集落现象也比以前更明显，细胞表面无典型树突样突起，符合imDC形态。经计数后平均每只小鼠可获得2.2×10~6个imDC。 2未成熟DC的电镜下形态 2.1扫描电镜下观察扫描电镜下imDC呈类圆形，细胞外部结构完整，表面皱着较多似云雾状，有少量的突起，但突起的长度短，较纤细，符合典型的imDC的形态。 2.2透射电镜下观察 imDC细胞形态规则，表面突起少，细胞微绒毛短小，细胞核偏向一侧且不规则，可以看到吞饮泡及较多的溶酶体。线粒体、核糖体、内质网数量中等。 3流式细胞仪检测imDC表面分子小鼠骨髓源未成熟树突状细胞高表达CD11c，纯度在90%以上。细胞表面分子CD80（25.03%±2.77%）、CD86（19.93%±4.31%）、MHC-II（23.93%±4.17%），均呈低表达，符合imDC表面标志物的特征。 4imDC对同种异基因T细胞的刺激增殖能力经免疫磁珠分选后的BALB/c小鼠脾脏T细胞，FCM检测其纯度大于90%。不同比例与各小时组的imDC与T细胞MLR刺激指数均说明imDC有刺激同种异基因T细胞增殖的能力（SI＞1），但各组刺激能力均很低。在加入CCK-8后的第2小时和第3小时分别检测各相邻imDC：T细胞比例的刺激指数，结果均无统计学差异（P＞0.05）；第4小时刺激指数与imDC所占比例呈正比，相邻各组间差异有统计学意义（P＜0.01）。结论: 1.本实验利用rmGM-CSF、rmIL-4体外诱导培养小鼠骨髓源imDC，并利用免疫磁珠分离提纯的方法提高了imDC的纯度，此方法培养出来的imDC具有典型的未成熟树突状细胞的形态，纯度较高。 2.从细胞形态、相对特异的表面分子的表达情况、对同种异基因T淋巴细胞的刺激增殖能力三方面证明体外培养所得细胞为未成熟的DC。在进行imDC与同种异型T细胞的单向混合淋巴反应时，用CCK-8法代替了传统的MTT法，使得实验结果更加稳定、可靠。此外，实验结果还证明了在加入CCK-84小时后为最佳的刺激指数检测时间。 3.本实验对小鼠骨髓源未成熟树突状细胞的体外分离培养、纯化和鉴定进行了改进，为研究imDC的功能及其在免疫疾病发病过程中的地位与治疗中的应用提供了实验基础。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】