微流体芯片筛选小鼠组织特异性表达miRNAs

发布时间：2020-01-23 18:27

【摘要】： 非编码RNA日益成为国际上研究的热点,它不仅能调控基因表达,而且与癌症密切相关。miRNA作为非编码RNA一部分,组织特异性表达是其一个重要特征,发现组织特异性表达的miRNAs是研究其生物学功能的第一步。另外,miRNA在不同的发育阶段以及不同的性别之间表达谱也不尽相同。本论文主要从以下三方面展开:(1)收集小鼠18种组织的miRNAs:利用EndNote,通过检索PubMed获得关于研究小鼠miRNA的文献约300篇,并精读文献收集小鼠各组织在不同发育时期和不同性别等各种条件下表达的miRNAs,为组织特异性表达miRNAs的筛选做准备;(2)采用微流体芯片技术筛选小鼠6种组织的miRNAs:微流体芯片技术具有灵活性强、自动化程度高、适用范围广、样品损耗少、无交叉污染和结果重现性好等特点,该技术的应用为高通量筛选基因表达提供了一种便捷、经济高效的方法。通过解剖获取四只C57BL/6小鼠六种组织:大脑,小脑,肝脏,肺,睾丸和肾。对于每种组织,分别取来自四只小鼠的等量组织混合后提取总RNA,利用尿素变性PAGE凝胶回收small RNA(smRNA,10-50 nt),分别将5’和3’RNA adapter连接到smRNA的两端,通过RT-PCR构建smRNA库(smRNA库中包含miRNA),利用非变性PAGE凝胶将miRNA对应的条带回收,最后通过荧光引物PCR(signal primer PCR)的方法对miRNA库进行荧光标记。利用微流体芯片对各组织表达的miRNA进行检测,该方法对痕量表达的miRNAs有很好的检测效果。为提高检测结果的精确度,取5次重复中至少有4次检测到信号的为可信结果,结果发现大脑中有246条miRNAs表达,小脑中有291条miRNAs表达,肝脏中有209条miRNAs表达,肺中有230条miRNAs表达,睾丸中有84条miRNAs表达,肾中有40条miRNAs表达。(3)结合(1)和(2)分析小鼠6种组织的组织特异性表达的miRNAs:通过对六种组织检测到的miRNAs进行比较筛选,得到除睾丸之外其它五种组织的组织特异性表达的miRNAs。为进一步得到更为可靠的结果,与基于大量文献收集的小鼠各组织在不同条件下表达的miRNAs进行再一次的比较筛选,结果发现,六种组织之间比较得出的组织特异性表达的miRNAs,有一部分miRNAs在其他组织中仍有表达。说明,信息学与实验学相结合是有力的科研手段。 微流体芯片技术与生物信息学的有机结合,不仅可以避免大量不必要的重复实验,节约成本,而且可以加快科研速度,提升科研水平。二者的有力结合也必将为生物学的发展带来新的契机。
【图文】：

图1.1 miRNAs生源论及其参与基因表达调控的两种机制Fig. 1.1 miRNAs biogenesis and two mechanisms involved in gene expressions基因经常成簇聚集在染色体上，在核仁内由RNA聚合酶转录形成pri-miR录本与mRNA相似，5’端有帽子结构，3’端有poly（A）。pri-miRNAs经D理，在核仁内行成大小为70 bp的pre-miRNA，pre-miRNAs在RNA-GTP的rtin 5输出到细胞质。在细胞质内，pre-miRNA经过Dicer酶处理产生:miRNA*双链体，miRNA*与miRNA互补。随后，解链酶将该双链体解链序列，miRNA*被降解，成熟的miRNA则形成由miRNA诱导的沉默A-induced silence complex, miRISC）[11, 12]。miRISC或者通过与mRNA的3’结合阻止蛋白质的合成（图1.1上右），或者通过与mRNA的不完全互补结A（图1.1下右）。因此，miRNA对其靶mRNA的两种调控机制依赖于二者在大多数情况下（例如在动物中），复合物中的单链miRNA与靶mRNA的补配对，从而阻断该基因的翻译过程，而靶mRNA的3’ UTR通常包含不同

字化光照合成设备，可进行皮升级的生物化学反应过程。功能化的微流体芯片特别适合于应用到微量样品的检测，且无交叉污染、重现性好等是其最大的优点。该技术使得在皮升级的反应室内合成高质量的DNA和RNA寡核苷酸成为可能。图1.2为微流体芯片结构特征模型图。微流体PicoArray反应器是由硅质材料经微电子装配程序制作而成，，该反应器包含三种拓扑特征：皮升级的反应室，微流通道以及输入和输出孔。微流体芯片上含有3698（128× 31）个单独的反应室，每个反应室容积为270 pl，锥形微流通道使得流入每个反应室的样品的流速均一，从而产生高密度均一的点。利用数字化光学装置对反应表面进行光蚀刻发射，这一技术能够在同一表面上大规模平行合成不同的分子，而不需要以前使用的昂贵而不便的微结构光掩膜。与此同时，定制的序列也可以通过简单的更改控制数字化光学装置的程序而合成。图 1.2 微流体反应器主要结构特征示意图Fig. 1.2 Schematic illustration and the major features of the microfluidic reactor寡核苷酸探针通过预先设定好序列布局图
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【共引文献】

相关期刊论文 前2条

1 刘强;郑秀峰;辛永红;;miRNA研究进展[J];重庆医学;2009年15期

2 汪作为;禹顺英;方贻儒;;微小RNA及其在精神疾病研究中的应用[J];中国神经精神疾病杂志;2010年08期

相关会议论文 前1条

1 卜范峰;鲁艳芹;韩金祥;;miRNA研究进展[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年

相关博士学位论文 前5条

1 赵建军;miRNA在脊髓发育及肿瘤分类中的作用[D];中国协和医科大学;2007年

2 申乐;PSD-95小干扰RNA沉默效率评估与功能研究[D];中国协和医科大学;2008年

3 王晓映;阿尔茨海默病中microRNA-34a作用机制的研究[D];中国协和医科大学;2009年

4 王冲;P19细胞分化过程中miRNA、bHLH因子及PcGs之间的相互调控[D];中国协和医科大学;2009年

5 戴毅;应用基因芯片捕获和新一代高通量测序技术建立Duchenne/Becker型肌营养不良基因诊断平台及相关临床应用[D];北京协和医学院;2013年

相关硕士学位论文 前5条

1 王亭;肝素预抗凝对家兔心肺复苏后急性肺损伤的防治作用[D];宁夏医科大学;2010年

2 邵长帅;Hsa-mir-129抑制人肾癌SN12-PM6细胞相关分子机制的初步研究[D];华中科技大学;2010年

3 石晓磊;MicroRNA-148a/b在胃癌中的表达及其功能与机制研究[D];第四军医大学;2011年

4 王燕;PIG11诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨[D];南华大学;2010年

5 张亚勤;葡萄糖代谢在肝癌细胞中通过mTOR信号转导通路激活热休克转录因子1[D];河南大学;2013年

本文编号：2572369