中国霍乱弧菌PFGE数据库的建立以及AFLP用于分型实验条件的研究

发布时间：2020-02-06 12:41

【摘要】： 霍乱一直是我国肠道传染病防治中的重要问题。自1961年以来,我国已经经历了三次霍乱流行高峰,近年又出现了O1群霍乱的流行和O139群霍乱的暴发。分子分型方法是追溯霍乱传染源,调查传播途径的主要手段,其中以PFGE的应用最为广泛。PulseNet China是以PFGE为核心技术的病原菌分子分型监测网络。本研究对我国历年收集的霍乱弧菌进行PFGE分析,建立了第一份有关我国40年霍乱流行的分子分型资料,揭示了1961年至今我国霍乱弧菌分离株的PFGE带型变化规律,同时建立了PulseNet China的霍乱弧菌PFGE带型数据库,为进一步研究我国霍乱弧菌分离株的进化规律提供了有效数据和基础信息。另外,本研究对AFLP用于霍乱弧菌分型的分辨力、重复性进行了评价,确定了AFLP用于霍乱弧菌分型分析的具体方法,并与PFGE进行了比较,为PulseNetChina发展新的分型技术奠定了实验和理论基础。 实验共选取了1961年-2007年全国26个省份分离的1254株O1群霍乱弧菌和517株O139群霍乱弧菌。菌株进行PFGE酶切电泳后得到图谱用BioNumerics软件处理,进行带型命名,计算菌株之间的相似性系数,按照相似性系数进行聚类分析(UPGMA方法)。NotⅠ酶切电泳将1216株O1群菌株分为722个不同带型,平均每种带型包含1.69株菌;将517株O139肝菌株分为169个不同带型,平均每种带型包含1.33株菌。SfiI酶切电泳将704株O1群菌株分为532个不同带型,平均每种带型包含3.06株菌;将115株O139群菌株分为53个不同带型,平均每种带型包含2.17株菌。各带型包含菌株数量多少不均,从1-80株不等。包含菌株数量最多的前2%的带型包含了所有菌株的约20%-40%。大部分(70%)菌株具有独特的带型,同时也有部分带型在不同年份和(或)不同省份存在。 通过对流行不相关菌株的分辨能力、对流行可能相关菌株的分辨能力和对具有相同核糖体型的菌株的分辨能力的比较,初步确定了NotI和SfiI对O1群霍乱弧菌的分辨能力均很好,后者略优于前者;对于O139群菌株,NotI的分辨能力明显优于SfiI;联合应用两种内切酶进行PFGE分型可以得到更多的型别,提高分辨能力。结合酶切效率、实验费用等因素我们建议在对霍乱弧菌进行PFGE分型时,以NotI为首选酶,NotI酶切得到相同带型的菌株可用SfiI进一步分型。 基于NotI酶切结果,对740株O1群产毒株进行了聚类分析,结果显示,PFGE带型随着年代变迁的现象比较明显,未发现PFGE带型在各地区之间的差异。1961年分离的菌株带型比较丰富,多样性较大;80年代分离菌株和90年代分离菌株相对保守,两者可以分为明显不同的类;引起2005年流行的菌株与先前菌株差异明显,可能是一个新出现的克隆。 基于NotI酶切结果,对417株O139群产毒株进行了聚类分析,分为117个不同带型,带型之间相似度大。并未发现带型与菌株分离年份或分离省份之间有明显的关联,也不能根据聚类结果对417株O139群菌株进行分类。 与产毒株相比,非产毒株的PFGE带型更加丰富,带型问差异更大,在聚类图中分布更加分散,提示非产毒株的基因组结构差异比产毒株大。 本课题还对AFLP用于霍乱弧菌分型的条件进行了初步研究,确定了发展AFLP成为PulseNet China分子分型技术的可行性。通过比较各对引物针对47株基因组有差异的霍乱弧菌的分辨力,确定了ApaI/TaqI针对霍乱弧菌的最佳引物组合为ApaI-T/TaqI-C,HindⅢ/TaqI针对霍乱弧菌的最佳引物组合为HindⅢ-A/TaqI-A。通过对3组内切酶分辨力的比较,确定用于霍乱弧菌AFLP分型的最佳内切酶及其引物组合为EcoRI-G/MseI-T。同时进行了AFLP和PFGE分型结果的比较,结果显示AFLP单独作为一种分型方法的能力不如PFGE,但两者的分型一致性较好,两者可以相互补充,联合应用。
【图文】：

C乙州左叨牛卜ZC到”010司1眨脚小创2阅2的刀洲2口，110，月阴洲圈.的门叩19肠SCZO〕1宁74KZGNI，01〔冲叫97田e恤曰二的1F.口扣巴1月7KZG刊，IOIC帕以扣1哑翻2侧巧翔夕.呀2只ZGN，，。，O幻别0，.甲到，朋O795洲ZGNll01月陌洲的油比1979璐二钊吠ZGNI佑0，心日叫92呻曰1泌，比肚椒豢眼夸澡李服降袭鑫错黔熟孰落魏封赓易JX19斗翻鸽眨CS12OI心N口173)即例SC口阅”润洲ZGSI加10川14日d“圈7肠KZGS，水)1尤日叫以抽如翻632翻认2GS12OI(〕扣114呼即以2M5KZGS，201丈卜扣”S拍哺白阅SD扫刀朋眨GS，201心户公.乃习祖nd沉月公〔防试ZGS，201仁卜口翁沙如.佣1洪阅2阅119791蛤3196月1阳21舫3a36株无明显流行病学关联的01群霍乱弧菌Notl酶切PFGE聚类图b36株无明显流行病学关联的01群霍乱弧菌邵I酶切PFGE聚类图.目口冲.，口哪口.，.‘一口钓朗目。二因侣一汤脚6‘.0呻外右盖名.，下已甲‘殆钊

d36株无I夕J{u二流行病学关联的0139胖粗乱弧菌划l酶 L)JPFGE聚类图图1一 1Noll和邵I对流行不相关霍乱弧菌的时间和分离地点_L分散的菌株进行实验PFGE聚类结果。尽可能，以降低选入菌株存在流地选川在分离行病学关联的可能性。所有菌株均为产毒株。勺
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 刘延清;霍乱的分子流行病学[J];海峡预防医学杂志;2002年01期

2 刘红露;张京云;冯泽惠;李伟;崔志刚;章丽娟;祝小平;阚飙;;脉冲场凝胶电泳分型技术在追溯O139霍乱传染来源中的应用[J];中华流行病学杂志;2006年02期

3 段广才，高守一，祁国明，刘延清，刘彩莲，，徐文斌;霍乱弧菌O139国内外菌株分子生物学特征比较[J];中华微生物学和免疫学杂志;1994年06期

本文编号：2576897