人多聚免疫球蛋白受体pIgR介导EMT的作用研究及机制初探

发布时间：2020-02-09 14:01

【摘要】： 多聚免疫球蛋白受体(pIgR)属于I型跨膜糖蛋白,可以与多聚免疫球蛋白A和多聚免疫球蛋白M特异性结合,通过穿胞转运,将它们从上皮细胞基底侧膜转运到顶膜,并最终分泌到外分泌液中去。MDCK是狗的肾上腺皮质细胞,该细胞株因适合作为上皮生物学模型而被广泛应用。在组织培养中,MDCK细胞能够形成上皮致密单层。本课题组前期实验利用真核转染技术,成功构建了人pIgR稳定高表达的MDCK细胞株(命名为MDCK-pIgR,阴性对照组细胞命名为MDCK-mock),在研究pIgR的极性转运时意外发现,MDCK-pIgR细胞株的增殖速加快,表型由柱状变为成肌纤维细胞样,并且,与MDCK-mock组细胞相比,这些细胞的运动性增强。进一步的表明pIgR的表达也许能够促进EMT的发生。本论文采用RNA干扰技术,研究pIgR介导EMT的作用。论文分三部分为内容。第一部分pIgR低表达细胞株的建立。设计并合成三种RNA干扰质粒,稳定转染MDCK-pIgR细胞,采用RT-PCR、Western-Blotting和免疫荧光化学技术检测干扰效率。结果显示,RNA干扰效果明显,可以用于后续的实验。第二部分pIgR介导MDCK细胞EMT的作用研究观察干扰组细胞与阴性对照组细胞形态变化,检测增殖相关指标,观察RNA干扰前后迁移、侵袭、粘附等细胞行为和软琼脂生长能力是否改变。结果显示,pIgR使MDCK细胞的形态发生显著变化,细胞的迁移、侵袭能力增强,而粘附力减弱,在软琼脂上的生长能力增强。以上结果说明,pIgR介导了MDCK细胞EMT的发生。第三部分pIgR介导EMT的可能分子机制初探在MDCK细胞模型中,pIgR的穿胞转运机制被广泛研究。在与配体结合或二聚化后,pIgR能够发生磷酸化。为了找到MDCK-pIgR细胞发生EMT的机制,我们采用RT-PCR、Western-Blotting等技术检测了ERK、Snail、角蛋白、F-actin,并采用IP方法探讨pIgR是否能够发生磷酸化调节细胞信号。推测pIgR介导EMT的可能分子机制为:pIgR的高表达促进ERK1/2磷酸化,上调Snail,下调E-钙粘素的表达,粘附连接破坏,细胞骨架重新排列,从而导致EMT的发生。而上述过程是由pIgR Tyr的磷酸化引起的。本论文的研究发现了pIgR在调节EMT中的作用,拓展了pIgR的研究领域。为pIgR的促肿瘤生成作用奠定了基础。提示pIgR是肿瘤治疗中的潜在靶点。基于进一步的评价,在特殊肿瘤组织中抑制pIgR的表达可能会成为阻断肿瘤转移的有效手段。
【图文】：

质粒,抽提,胞转,经密

图 2 RNA 干扰质粒测序结果干扰质粒大量抽提结果扰质粒大量抽提后进行电泳，结果表明：三种质粒浓度及纯度较高，符合胞转染要求。经密度扫描确定浓度，决定真核转染实验的质粒用量为20μL/4 孔板，细胞融合度 70-90%）。2000bp10007505004500bp

化学检测,蛋白质表达,免疫荧光

图 6 免疫荧光化学检测 pIgR 的蛋白质表达结果利用 pIgR 抗体对两组细胞进行免疫细胞化学染色，二抗为 CY3 标记（红色荧光）的抗小鼠 IgG。（A）MDCK-mock；（B）MDCK-pIgR：（C）NC；（D）干扰 1；（E）干扰 2；（F）干扰 34 讨论本部分实验的稳定转染采用了 Invitrogen 公司的脂质体 LipofectamineTM2000介导转染过程，该试剂具有转染效率高、易于操作、工作浓度下细胞毒性小的优点。转染使用的质粒 DNA 采用常规质粒大量抽提方法并加以改良，进行了纯化处理，，去除了杂蛋白以及具有细胞毒性的酚、氯仿等物质。同时，我们延长了脂质体-DNA 与细胞共孵育时间，共孵育 6h 后并没有弃去转染液，而是加入血清
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】