ING4基因在肿瘤发生中的检测及其慢病毒载体的构建

发布时间：2020-02-08 23:50

【摘要】： 目的观察ING4基因在肿瘤发生中转录水平的变化和突变情况;克隆人骨髓间质干细胞ING4(inhibitor of growth famility,member4)基因,改造慢病毒表达载体并构建ING4基因慢病毒表达载体PNL-ING4 方法培养多种肿瘤细胞株,包括肺腺癌细胞株(A549)、宫颈癌细胞株(Hela)、结肠癌细胞株(SW480)、小细胞肺癌细胞株(LTEP-a-2)、前列腺癌细胞株(PC3)、白血病干细胞(LSC)及hMSC来源肿瘤细胞(F6)和胃癌组织中分离的间质干细胞(GC-MSC),以成人骨髓间质干细胞(hBM-MSC)、人脐静脉内皮细胞(UVEC-304)为对照,收集白血病患者骨髓和胃癌患者癌组织,采用RT-PCR和Real-Time PCR技术研究各种细胞、白血病患者骨髓和胃癌组织中ING4基因的表达水平变化;从hBM-MSC、LSC、SW480、F6和慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞cDNA中克隆ING4基因并测序观察ING4基因的突变情况;经RT-PCR扩增出hBM-MSC来源的全长ING4cDNA,克隆、鉴定并测序后与重组改造慢病毒表达载体PNL-ires连接,构建慢病毒表达载体PNL-ING4,经双酶切、基因测序进行鉴定。采用脂质体方法转染293T细胞,通过RT-PCR检测ING4基因的表达。 结果RT-PCR表明在LTEP-a-2、SW480、LSC、Hela、PC3、F6、GC-MSC、hBM-MSC、UVEC-304、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓中有不同水平ING4基因表达,其中LSC、ALL和CML患者骨髓中表达量较低,而在A549和胃癌患者癌组织中表达量极低。定量PCR显示,ING4基因在A549、LTEP-a-2、SW480、GC-MSC、PC3、Hela、UVEC-304、hBM-MSC和F6中均有表达,表达量以A549最低,F6最高,而UVEC-304和hBM-MSC居中。全长测序显示,在hBM-MSC第七代和第九代、LSC、SW480、F6、CML患者骨髓中均发现缺失及错配,缺失大部分发生在NLS域内,错义突变和移码突变也有发现。且随着骨髓间质干细胞传代数目的增多,点突变和缺失的频率也越来越高。从hBM-MSC中克隆ING4基因全长并改造慢病毒表达载体PNL-ires,构建了PNL-ING4慢病毒表达载体,双酶切和基因测序正确。包装293T细胞后可见绿色荧光,转染效率可达80%以上,并可检测出ING4基因的表达。 结论ING4基因在不同肿瘤细胞中呈不同水平的表达,部分表现出表达产物发生突变。这些因素都是通过改变ING4的表达水平或生物活性,参与肿瘤的发生,特别值得关注的是,在MSC体外突变致瘤中,ING4表达突变是其中一个重要原因。成功构建ING4慢病毒表达载体PNL-ING4,为研究ING4基因在肿瘤发生中的作用与肿瘤基因治疗奠定基础。
【图文】：

图3.2荧光定量PCR扩增ING4及B一actin基因标准曲线和扩增曲线A、B为ING4基因标准曲线;C、D为B一actin基因标准曲线;E为ING4基因融解曲线;F为B一actin基因融解曲线;G为ING4基因扩增曲线;H为B一actin基因扩增曲线;ING4标准品浓度分别为102、103、一04、B一aetin标准品浓度分别为103、104、105、205、lo6copies恤l:106、一07、loseopies/PI。Fig.3.2StandardeurveandamPlificationcurveofreal一timePCRforING4geneandB一actingeneA、BwerethestandardeurveofING4gene;C、DwerethestandardeurveofB一actingene:EwasdilaPsuseurveofING4gene:FwasdilaPsuseurveofB一actingene;GwasamPlificationeurveofING4gene:HwasamPlificationeurveofB一aetingene:ThestandardsamplesofING4wereloZ、10，、104、10，、lo6eopies扭l:24

图3.3Real一timePCR测定细胞株中ING4基因表达每个条形柱代表三次独立实验的平均值(巧D)Fig.3.3real一timePCRforING4geneEacheolumnrePresentsrhemeanofthreeindividualexperiments(士SD)表3.2各肿瘤细胞株ING4和p一actin拷贝数名称A549LTEP一a一2SW480GC一MSCPC3HELAUVEC一304hBM58416.9*1049.4*1033*1020.2*1013.8*1051.5*103215*1062.4*10一‘31.7*1046.1189*IOb2.61*10一4160*106233*10b98.9*1061.4*10一4310*1061.02*10一4288tin3.46*10一52.06*10一48.67*10一51.6*
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346;R730.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 饶国洲;李昂;朱永进;石建峰;苟建重;张引成;;BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年07期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相关会议论文 前1条

1 刘莉;采克俊;张易祥;李景芬;何湃;;MxA重组慢病毒的构建及其体外感染鸡精原干细胞[A];第二届中国医学细胞生物学学术大会暨细胞生物学教学改革会议论文集[C];2008年

相关博士学位论文 前5条

1 全智华;人SR-PSOX/CXCL16基因转染和沉默及其对动脉粥样硬化相关功能的影响[D];南华大学;2007年

2 陈小艳;LMP1~+/mCD99L2~-A20诱导小鼠A20细胞转化为H/RS样细胞的研究[D];南方医科大学;2009年

3 李金东;RNAi沉默Med19基因对人肺癌A549细胞生长、转移影响的实验研究[D];吉林大学;2009年

4 陆小明;RNAi抑制miR-221对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究[D];南京医科大学;2012年

5 陈建军;骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植通过AKT/ERK相关途径促进缺血心肌血管新生[D];中南大学;2012年

相关硕士学位论文 前3条

1 张蕾蕾;ING4基因在肿瘤发生中的检测及其慢病毒载体的构建[D];江苏大学;2008年

2 李跃艳;重组人结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受体（SR-PSOX）的表达及其功能研究[D];南华大学;2007年

3 王华;栉孔扇贝（Chlamys farreri）心肌组织细胞培养的初步研究[D];中国海洋大学;2009年

，

本文编号：2577645