烟曲霉感染对HUVEC表达TF、vWF及细胞凋亡的影响

发布时间：2020-02-11 05:46

【摘要】： 目的：通过建立烟曲霉菌丝感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell HUVEC)的体外模型,①观察烟曲霉菌丝感染后HUVEC表达组织因子(tissue factor TF)和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor vWF)的水平；②分别用细胞松弛素D、N-钙粘蛋白单克隆抗体或地塞米松处理HUVEC,观察烟曲霉菌丝感染后HUVEC表达TF和vWF的变化,以探讨侵袭性曲霉病血管侵袭的机制。 方法：接种于24孔板的HUVEC长满融合后,加入预先配置的浓度为1×105CFU/ml烟曲霉菌丝悬液,建立烟曲霉菌丝感染血管内皮细胞模型。实验分为六组,每组总反应体积200μl,即①空白对照组：细胞不予任何刺激；②TNF-α组：细胞予TNF-α(浓度100 ng／ml)刺激；③烟曲霉菌丝组：烟曲霉菌丝悬液浓度为105 CFU/ml;④细胞松弛素D组：HUVEC长满融合后,实验前10min用细胞松弛素D溶液处理,加入配制好的烟曲霉菌丝悬液(细胞松弛素D终浓度为70 nmol/L,烟曲霉菌丝悬液浓度为105 CFU/ml);⑤N-钙粘蛋白抗体组：HUVEC细胞长满融合,予浓度1：100的小鼠抗人N-钙粘蛋白单克隆抗体处理1h后,加入配制好的烟曲霉菌丝悬液(烟曲霉菌丝悬液浓度为105CFU/ml);⑥地塞米松组：地塞米松和烟曲霉菌丝同时加入(地塞米松浓度为10-4mol／L,烟曲霉菌丝悬液浓度为105CFU/ml)。加入烟曲霉菌丝后,分别于共培养0、2、6、12、18h终止实验以获取细胞冻融液和2、6、12、18h提取细胞培养上清液,采用ELISA法分别检测TF、vWF浓度。 结果： 一、TF变化：除空白对照组外,各实验组HUVEC的TF表达量在2、6、12、18h与0h比较均升高(P0.05),而空白对照组则无明显变化；各组间0h的TF表达量差异无统计学意义；各实验组HUVEC的TF表达量在2、6、12、18h高于空白对照组(P0.05)；TNF-α组HUVEC的TF表达量在2、6、12h分别为503.64±53.26ng/L、1272.60±186.38ng/L、908.97±133.11 ng／L,明显高于烟曲霉菌丝组相应时间点的387.33±57.05 ng／L、523.56±74.26ng／L、659.76±91.40 ng／L(P0.01)；细胞松弛素D组与烟曲霉菌丝组比较,TF表达量在各时间点差异均无统计学意义；N-钙粘蛋白抗体组的TF表达量在2、6、12h分别为300.12±47.31ng/L.378.61±72.27ng/L、509.86±67.57ng/L,低于烟曲霉菌丝组相应时间点的387.33±57.05 ng/L.523.56±74.26 ng/L.659.76±91.40 ng/L(P0.05)；地塞米松组与烟曲霉菌丝组比较,HUVEC的TF表达量在各时间点差异均无统计学意义。 二、vWF变化：与2h比较,空白对照组和TNF-α组的vWF表达量在18h增加(P0.05),其余各组vWF表达量在6、12、18h均增加(P0.05)；各实验组与空白对照组比较,除N-钙粘蛋白抗体组HUVEC的vWF表达量在2h无明显变化外,其余各时间点vWF表达量在2、6、12、18h均升高(P0.05)；TNF-α组HUVEC的vWF表达量在2h为64.45±7.58ng/mL,高于烟曲霉菌丝组51.49±6.41 ng/mL(P0.05),而在18h为91.05±18.90 ng/mL,低于烟曲霉菌丝组133.73±19.49 ng/mL(P0.05)；细胞松弛素D组HUVEC的vWF表达量与烟曲霉菌丝组比较在各时间点差异均无统计学意义；N-钙粘蛋白抗体组HUVEC的vWF表达量在2h、6h分别为38.95±6.26 ng/mL和61.99±5.41 ng/mL,低于烟曲霉菌丝组相应时间点的51.49±6.41ng/mL和78.66±10.43 ng/mL(P0.05)；地塞米松组与烟曲霉菌丝组vWF表达量在各时间点差异均无统计学意义。 结论：本实验结果提示：①建立烟曲霉菌丝感染HUVEC的体外模型是可行的；②烟曲霉菌丝感染造成HUVEC损伤,过度表达TF和vWF；③细胞松弛素D对烟曲霉菌丝感染后HUVEC表达TF及vWF无明显影响；④N-钙粘蛋白单克隆抗体可抑制烟曲霉菌丝感染后HUVEC表达TF及vWF；⑤地塞米松对烟曲霉菌丝感染的HUVEC表达TF及vWF无明显影响。 第二部分烟曲霉菌丝诱导HUVEC凋亡 目的：应用烟曲霉菌丝感染HUVEC体外模型,观察烟曲霉菌丝感染后HUVEC的凋亡情况。 方法：建立烟曲霉菌丝感染HUVEC的体外模型(具体同第一部分)。实验分三组：①空白对照组,细胞不予任何刺激；②烟曲霉菌丝组I(浓度105CFU/mL)；③烟曲霉菌丝组Ⅱ(浓度106CFU/ml).用流式细胞仪于2、4、8h三个时相点检测HUVEC凋亡率。 结果：除空白对照组外,暴露于烟曲霉菌丝组Ⅰ和Ⅱ的HUVEC凋亡率在2、4、8h逐渐增加(P0.05)；烟曲霉菌丝组I2、4、8h的HUVEC凋亡率分别为9.76±1.47%、13.47±1.83%、20.08±2.36%,明显高于空白对照组相应时间点的1.61±0.17%、1.72±0.16%、1.84±0.18%(P0.01)；烟曲霉菌丝组Ⅱ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分别为12.25±1.44%、16.57±2.28%、24.31±3.37%,也明显高于空白对照组相应时间点的HUVEC凋亡率(P0.01),且高浓度烟曲霉菌丝引起细胞凋亡率高于低浓度烟曲霉菌丝(P0.05)。 结论：烟曲霉菌丝可诱导HUVEC凋亡。一定时间内,随HUVEC接触菌丝时间的延长,凋亡率增加；相同时间点,烟曲霉菌丝浓度越高,HUVEC凋亡率越高。
【图文】：

各组TF表达量注:与oht匕较，，*P<0.05，**P<0.0一;与空白对照组比较，莽P<0.05，“岸P<0.01;

各组vWF表达量注:与oh比较，*P<0.05，**P<0.01;与空白对照组比较，岸P<0.05，洲灯P<0.01;与烟曲霉菌丝组比较，争<0.05
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：2578387