MxA蛋白的抗体制备及其特异性分析

发布时间：2020-02-28 21:58

【摘要】： MxA蛋白是I型干扰素(INF-α/β)所诱导的蛋白,具有广泛的抗病毒活性(主要针对RNA病毒)。此蛋白产物的诱导动力学特征与细胞的抗病毒状态呈完全的平行,病毒感染时内源性干扰素明显升高,MxA可反映内源性干扰素的状态,从而间接反映病毒感染,因此MxA量的升降可作为病毒感染的一个特异的指标。在国外,该蛋白已经引起了广大研究者的关注,并进行了深入的探讨;在国内,近年来也逐渐引起学者的兴趣。随着MxA蛋白的深入研究,迫切需要制备对应抗体来开展该项研究工作,而且MxA作为病毒感染的特异性指标,抗MxA单克隆抗体制剂本身也具有开发利用的潜能,具有广阔的应用前景。尽管国外已有该蛋白的特异性多抗和单抗,但均未商品化,在国内并未曾有有关报道,因此我们有必要在国内制备对应的高特异性的多抗和单抗供广大研究工作者使用,并研制MxA快速检测试剂盒抢占中国市场,为广大医患服务。 本研究在已获得该基因并重组入克隆载体的基础上,通过基因工程方法构建原核表达载体pET-32a(+)-MxA,并在工程菌BL21中获得高效表达,蛋白含量可达菌体总蛋白量的25%,以割胶纯化的纯度达90%以上的目的蛋白进行腹腔注射免疫小鼠并利用不同形式的MxA蛋白作为抗原对抗血清进行特异性分析,结果表明获得了特异性较高的抗血清;继而使用PEG4000利用细胞融合技术将该蛋白免疫的Balb/c小鼠的脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞融合,经三轮单克隆后成功地获得了分泌该蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为杂交瘤细胞3C2,利用Western-blot、免疫细胞化学、免疫细胞荧光和免疫沉淀试验等各种免疫学方法检测其抗体的特异性和效价,并通过抗体纯化技术对大量制备的腹水进行浓缩和纯化,利用间接ELISA法对纯化蛋白进行效价评定,实验最终得到了高效而特异性强的抗MxA蛋白的单克隆抗体。所得结果不仅为MxA基因和MxA蛋白的理论研究提供免疫学实验材料,也为研制MxA快速检测试剂盒奠定了坚实的基础。
【图文】：

片段(0.96kb，1.05kb)，，与预期的分子量一致（如图 1-1）；（2）对该质粒的双酶切，切出分子量分别为 2kb、5.9kb 的二条 DNA 带，而对照 pET-32a(+)质粒仅切出一条分子量为5.9kb的DNA带（如图1-2）。说明MxA基因已经正确的连接在pET-32a(+)载体上，成功构建了重组质粒 pET-32a(+)-MxA。2.2 pET-32a(+)-MxA 转化菌的诱导表达将 pET-32a(+)-MxA 重组质粒转化原核表达系统菌株 BL21(DE3)，抽提质粒并电泳鉴定，筛选出成功转化的转化菌 pET-32a(+)-MxA/BL21，并将该新鲜过夜培养菌按 1：100 接种于含 75μg/ml AMP 的 2YT 培养基中，37℃培养至 OD600为 0.5，补加 IPTG 至终浓度为 0.2mmol/L，28℃继续培养 4h。收集菌体

导表达量最少（如图 1-6）。通过上述结果，优化出最佳诱导条件即 0.2mmol/l IPTG于 28℃ 诱导 4h。图1-4 不同的IPTG诱导浓度对MxA基因表达影响a-g：0.2、0.6、1.0、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mmol/L终浓度 IPTG 诱导 5h 的表达产物图 1-3 pET-32a(+)-MxA/BL21 转化菌的诱导表达a：预染蛋白分子量 Markeb：pET-32a(+)-MxA / BL21 诱导菌体蛋白c：pET-32a(+)-MxA /BL21 未诱导菌体蛋白d：pET-32a(+)/BL21 诱导前菌体蛋白e：pET-32a(+)/BL21 诱导菌体蛋白Trx-MxAa b c d e fa b c d e f g9766482619kD12
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 佘茜;徐蕾;何永林;靳志栋;张丹;杨春;;结核分枝杆菌PPE68蛋白的表达、鉴定及抗血清的制备[J];免疫学杂志;2011年09期

2 阎卉芳;沈宏伟;王向平;施小六;;兔抗人LOH12CR1抗血清的制备方法[J];肿瘤药学;2011年04期

3 刘兵;曾华金;杨冉;雷利芳;屈凌波;;抗恩诺沙星抗血清的制备及其ELISA检测[J];药物分析杂志;2011年07期

4 王乃东;袁安文;邓治邦;屠迪;许道军;夏南松;杨大为;薛立群;;血清学检测的雄性特异性抗原Fab抗体的特异性鉴定[J];畜牧兽医学报;2011年08期

5 施海晶;王丽春;王晶晶;廖芸;刘龙丁;;HSV-工诱导的细胞蛋白H347的初步分析[J];云南大学学报(自然科学版);2007年S3期

6 王健理;姚晓英;李大金;;重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3经鼻腔免疫BALB/c小鼠的抗生育潜能[J];中国免疫学杂志;2011年07期

7 刘沙洲;桑小雪;欧阳华学;雷绍荣;白林含;;新霉素ELISA检测方法的建立[J];食品科学;2011年14期

8 叶维建;郑玉涛;叶玲玲;蔡兆明;;胎儿供体胰腺胰岛移植的解剖学观察[J];辽宁医学院学报;2011年04期

9 黎英荣;肖常青;戎健;潘海林;苏宏业;邓宏明;;糖尿病大鼠阴茎组织糖基化终产物含量的变化和糖基化终产物受体的表达情况[J];中国糖尿病杂志;2007年09期

10 范泉水;郑颖;王双印;邱薇;张连江;尹惠琼;李丽红;;中国常见毒蛇抗蛇毒F(ab′)_2抗体制备[J];云南大学学报(自然科学版);2007年S3期

相关会议论文 前10条

1 马春全;黄兴国;邓小雄;顾万军;;鸭卵黄IgG的纯化及兔抗鸭IgG血清的制备[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年

2 魏群;贾振宇;陈萍;王林波;曹江;;eIF3g GST融合蛋白的表达与兔抗血清的制备[A];浙江省免疫学会第六次学术研讨会论文汇编[C];2007年

3 徐国良;张卓辉;张增珠;张启云;;双黄连注射剂过敏症动物模型的实验研究[A];第九届全国中药和天然药物学术研讨会大会报告及论文集[C];2007年

4 范泉水;余方芳;郑颖;;用生物信息学方法和多抗原表位DNA免疫方法设计制造生物毒素抗血清[A];第八届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2007年

5 赵丹慧;张艳;李成文;;人甲状旁腺激素基因表达产物及合成肽抗体的制备[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

6 雷红涛;方坚生;孙远明;王弘;沈玉栋;黄晓钰;冯伟雯;;丁草胺人工抗原及抗体制备研究[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年

7 王朝辉;李大伟;韩成贵;于嘉林;;RBSDV P10蛋白原核表达及其抗血清的制备与应用[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年

8 王永久;由振东;崔瑞耀;路长林;何成;;大鼠脑中催产素受体cDNA的克隆和在大肠杆菌与CHO细胞内的表达[A];全面建设小康社会：中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集（下）[C];2003年

9 严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;鳜鱼病毒核酸特异片段表达及高效价抗体制备[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年

10 周常文;马纪萱;高远;迈迪娜;吕兆启;;抗雄烯二酮独特型抗体的制备及其性质[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

相关重要报纸文章 前10条

1 管维邋石先来;中山局研制出植物病毒抗血清[N];中国国门时报;2008年

2 海波邋通讯员 石先来;中山研制出三种病毒抗血清[N];广东科技报;2008年

3 记者 黄启艳邋通讯员 管维 石先来;其潜在价值超过亿元[N];中山日报;2008年

4 王永坤 钱钟 秦淑美 王晖;防治小鹅瘟的有效措施[N];中国畜牧报;2005年

5 张永振;被动物咬伤后怎么办[N];健康报;2006年

6 方成;植物病毒检疫技术获得突破[N];中国知识产权报;2008年

7 本报记者 王均珠;狂犬病防治还有待加强[N];贵阳日报;2008年

8 徐述湘;规范预防措施以减少狂犬病[N];中国医药报;2004年

9 胡德斌;应用灭活疫苗防鹅疫[N];农民日报;2006年

10 东平县畜牧局 董泽秋 张灿东 刘琰冰 提供;蛋鸭的疾病与防治[N];山东科技报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 李永芹;养殖鱼类病原菌检测芯片技术的建立[D];中国海洋大学;2010年

2 陈婷梅;人胱抑素C抗体制备和检测方法建立及其方法学评价[D];重庆医科大学;2007年

3 王瑞琳;SARS冠状病毒分离鉴定、疫苗构建及免疫血清制备研究[D];吉林大学;2006年

4 王洁;沙眼衣原体感染体液免疫应答谱的建立及Tarp蛋白生物学特性的研究[D];中南大学;2011年

5 吴润;偶蹄动物朊蛋白基因结构特征及其重组蛋白抗原性的研究[D];甘肃农业大学;2004年

6 侯秋莲;应用SSH技术研究氧化胁迫下细粒棘球蚴基因的表达[D];新疆大学;2008年

7 李萌;CD20分子模拟表位肽的筛选及其疫苗构建[D];第四军医大学;2006年

8 吕俊;LINGO-1多克隆抗体的制备及其被动免疫治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究[D];南方医科大学;2010年

9 陈益国;金葡菌肽聚糖模拟肽疫苗候选保护性作用的初步研究[D];南方医科大学;2011年

10 江红;幽门螺杆菌空泡毒素基因分段克隆、表达和活性研究[D];第四军医大学;2001年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘鹏;MxA蛋白的抗体制备及其特异性分析[D];苏州大学;2008年

2 李绪友;昆虫围食膜蛋白抗体对杆状病毒感染性的影响[D];华中师范大学;2006年

3 姜艳华;猪链球菌不同血清型抗血清的制备及在病原流行病学调查中的应用[D];南京农业大学;2008年

4 曾华金;CMV-CP基因高效表达与抗血清的制备[D];华南热带农业大学;2003年

5 陆健康;抗玉米赤霉烯酮和抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的制备及性质分析[D];华中农业大学;2010年

6 李德昆;河豚毒素的快速检测方法研究[D];中国海洋大学;2004年

7 李袁飞;凋亡相关新基因apr-2的克隆、表达及多克隆抗血清的制备[D];第四军医大学;2004年

8 呼都特;蒙古马不同类群MxA基因的部分外显子多态性分析及MxA基因真核载体的构建[D];内蒙古农业大学;2010年

9 赵海林;人Tenascin-R蛋白EGFL片段抗血清治疗中枢神经损伤的体外研究[D];南方医科大学;2012年

10 胡春超;兔抗ES细胞免疫血清对附植前小鼠胚胎的作用[D];河北农业大学;2012年

本文编号：2583571