工频磁场对胎鼠大脑皮质神经元的影响

发布时间：2020-02-28 23:27

【摘要】： 研究目的： 随着电力事业的飞速发展和各种电器设备的广泛应用，人们生活空间中所接触到的工频磁场辐射日益增多。许多研究表明工频磁场是危害性非常大的污染源，严重影响人体健康。因此，工频磁场的生物效应便成为生物电磁学领域的一个重要课题。 在人体各系统中，中枢神经系统是对电磁辐射最敏感的系统，神经元是神经系统结构和功能的基本单位，要深入探讨工频磁场对神经系统的生物学作用，，就必须开展工频磁场对神经元作用的研究。工频磁场对神经元的生物学效应是磁场和神经元共同作用的结果，是与两者的参数密切相连的。工频磁场的强度、作用时间，接受磁场作用的神经元的来源、部位、生长状态等参数都是影响工频磁场生物学效应的主要因素。 本课题对体外培养胎鼠皮质神经元施加工频磁场辐射，旨在探讨工频磁场(50-60Hz)对胎鼠皮质神经元的损伤效应，并综合分析其可能机制。 研究方法： 以Wistar孕大鼠13．5～14d的胚胎原代培养的大脑皮质神经元为实验材料。神经元培养48h后，随机分为对照组和实验组，对实验组神经元施加工频磁场辐射，主要参数选择：重复频率50Hz、平均场强0．3mT，30min／次，3次／d，共2d。辐射完毕12h后，分别对对照组和实验组神经元进行以下检测： 1．细胞形态学观察： (1)倒置显微镜观察：在倒置显微镜下观察神经元的生长情况。 (2)透射电子显微镜观察：辐射完毕12h后，3％戊二醛预固定10min，用细胞刮刮下细胞并转移到离心管中，经离心、固定、脱水、包埋、切片、染色等处理，JEM-1200EX型透射电子显微镜观察记录。 (3)扫描电子显微镜观察：将细胞接种于预置盖玻片的培养板中，辐射完毕12h后，2．5％戊二醛前固定，用0．1mol／L磷酸缓冲液冲洗数次，1％锇酸后固定，再用乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换，二氧化碳临界干燥，高真空蒸发仪喷镀，扫描电子显微镜观察记录。 2．相对存活率测定：四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)测定实验组神经元的相对存活率。 3．细胞死亡的检测：采用Ho33342、PI荧光双染的方法观察对照组和实验组的细胞死亡情况。 4．流式细胞术测定神经元胞浆内游离Ca~(2+)浓度的变化：收集细胞，加Fluo3／AM至终浓度为10μmol／L，避光孵育1h。利用流式细胞仪检测(激发波长为506nm，发射波长为526nm)，取10000个神经元荧光强度值的平均值为各组测定值。 5．流式细胞术测定线粒体膜电位：收集细胞，加罗丹明123至终浓度为10μg／ml，孵育30min。利用流式细胞仪检测(激发波长为488nm，发射波长为530nm)，取10000个神经元荧光强度值的平均值为各组测定值。 6．脂质过氧化测定：辐射完毕12小时后收集细胞(10~6个)；超声波破碎细胞；4℃超速离心机12000rpm／m离心15分钟后取上清；依试剂盒说明书进行各步骤反应；721分光光度仪分别测定各组细胞内MDA含量和SOD活性。 结果： 1．细胞形态学观察： (1)倒置显微镜观察：对照组神经元24h后绝大多数已贴壁，分散均匀；有的神经元伸出长短不等的突起，少数神经元之间已建立突起联系。培养48h后，神经元之间已建立广泛的突起联系。96h后神经元胞体饱满，立体感强，神经元的突起表面平滑。实验组神经元生长状态欠佳，胞体欠饱满，神经元之间也有突起联系，但是突起表面粗糙，与对照组神经元的形态有明显差异。 (2)透射电子显微镜观察：对照组神经元常染色质丰富；胞浆中线粒体、内质网、高尔基复合体丰富，胞浆及突起内富含微管、微丝。实验组神经元胞浆内部分线粒体嵴排列紊乱，偶见巨大线粒体；大量神经元胞浆中自噬体和残余溶酶体明显增多，有的甚至充满细胞浆，高倍下可见这些小体由单层膜或双层膜包绕，呈高电子密度；内质网扩张，腔内潴留物增多，高尔基复合体欠发达。 (3)扫描电子显微镜观察：对照组神经元有大量的长短不一的突起，伸出的突起与临近细胞的突起相连，胞体及突起表面光滑。实验组与对照组相比细胞形态发生明显的变化，细胞突起收缩、断裂，胞间连接断裂，胞体及突起欠光滑，其表面有较多毛刺状突起，胞质中可见较多颗粒。 2．细胞死亡的检测： Ho33342和PI双标：对照组中的细胞核质均匀，呈现蓝色荧光；磁场照射组出现呈红色荧光的坏死细胞，部分细胞出现染色质凝集、边缘化现象。 3．相对存活率测定：对照组和实验组神经元光密度(A_(570))值分别为0．515±0．029和0．398±0．016。 4．神经元胞浆内游离Ca~(2+)浓度的测定：对照组和实验组神经元胞浆内游离Ca~(2+)平均荧光强度分别为91．23±1．16和88．42±2．08。 5．线粒体膜电位测定：对照组和实验组神经元线粒体膜电位平均荧光强度分别为63．34±1．55和44．36±1．73。 6．脂质过氧化测定：对照组和实验组神经元MDA含量分别为13．24±0．36和18．67±0．45；对照组和实验组神经元SOD活性分别为32．98±1．35和17.74±0.96。 结论： 本实验条件下，工频磁场(重复频率50Hz、平均场强0．3mT)可导致体外培养的胎鼠皮质神经元的形态发生明显变化，并可抑制其生长，造成其代谢异常、线粒体膜电位降低、MDA含量升高和SOD活性降低。胞浆内游离Ca~(2+)浓度基本无变化，可能是与辐射时间的长短、辐射次数及辐射完毕与收集细胞之间的时间间隔有关。因此，探讨工频磁场的生物学效应需要综合分析多项指标，并应深入考虑。 意义： 本课题选择工频磁场(50Hz)作用于体外培养的胎鼠皮质神经元，揭示了工频磁场辐射对离体神经元的损伤效应及其可能机制，为进一步探讨工频磁场对神经系统的生物学效应及其机制提供了实验资料。
【图文】：

对照组和实验组神经元光密度(A57。)值分别为0.515士0.029和0.398士0.实验组神经元相对存活率为77.28%，两组差异有统计学意义护<0.01)。两组元的A57。值及相对存活率见表1及图6。表1MTT法测定神经元相对存活率(，士‘，n=8)琳le1Therelativevi汕ility。fneuronsoftwo脚ups(釜士‘，n=8)组别A57。值细胞相对存活率(%)对照组实验组0.515士0.029100.000.398士0.016*77.28**尸<0.01VS对照组*P<0.01VSConlr01GrouP

对照组和实验组神经元胞浆内游离c扩+平均荧光强度分别为91.23士1.16和88.4肚2.08，实验组比对照组降低3.08%，两组差异无统计学意义(P>0.05)。两组神经元线粒体膜电位平均荧光强度值见表2及图7。表2神经元胞浆内游离钙离子荧光强度(王士才，n=10000)琳 le2Fluoreseeneevalueorthe毗aeellular。 aleiumeoneentration(釜士，，n一10000)组别荧光强度对照组实验组 91.23士1.1688.42士2.08**乃 0.05VS对照组*介 0.05VSControlGrouP CUnU0

本文编号：2583595