基于HLA三维结构模建预测GVHD的基础与临床应用研究

发布时间：2020-03-06 23:13

【摘要】： 异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)在临床中应用于对多种恶性血液病的治疗,同时对部分实体瘤、遗传代谢性疾病及自身免疫性疾病等疾患有显著疗效,但受多种因素的影响,不同个体allo-HSCT术后疗效迥异。移植供受者间主要组织相容性复合体(MHC,人类又称为HLA)的错配所引发的急重度移植物抗宿主病(GVHD)是影响allo-HSCT预后的最关键因素之一。2008年美国国家骨髓库(NMDP)制订的allo-HSCT配型手册提出:HLA-A、-B、-Cw、-DRBl四个位点8/8高分辨匹配是allo-HSCT供者选择的最佳标准;无全相合供者时,建议接受HLA-A,-B,-Cw,-DRB1位点中有一个等位基因错配的供者。但对于何种HLA错配是具有相容性的或何种HLA错配不引发急重度GVHD这一问题目前仍没有明确答案。因此,随着HLA不全相合allo-HSCT移植病例的增多,如何评估任意两个不同HLA分子的相容性程度就成为临床移植免疫学与基础医学研究都非常关注和亟待解决的关键问题。无法判断不完全相合供受者间HLA相容程度时,人们用HLA的功能匹配、序列匹配、结构匹配等评价方式来进行相容性评估。传统的混合淋巴细胞培养(MLC)及群体反应性T细胞(PRT)试验等都依赖体外细胞学实验,结果不稳定且不适于高通量供者筛选,不能评估所有HLA分子间的相容性。目前亦有根据HLA氨基酸序列分析其功能差异的理论,及根据HLA-Pep-TCR复合体间的结合能来分析HLA相似性的报道,遗憾的是这些理论假设大都缺乏临床数据支持而遭到质疑。针对上述现状,本课题根据蛋白质的结构决定其功能的理论基础,提出基于HLA分子空间结构差异优化选择allo-HSCT最佳供者的设想并进行了如下研究。鉴于MHC极具多态性、连锁不平衡性及地区民族差异性,我们首先研究了本地区、本民族的HLA基因遗传特征。我们统计了1014例汉族人群HLA-I、-II类经典基因座位的基因频率及单倍型频率,并分析了HLA基因的连锁不平衡、人群及地区分布等群体遗传学特征。结果显示:汉族人群中较为常见的HLA-I、-II类基因有A*02(0.33),B*15(0.14),Cw*03(0.25),DRB1*15(0.170),DQB1*06(0.218)等。HLA-I类基因较为常见的单倍型是A*02-B*46(0.071),A*02-Cw*01 (0.084),B*46-Cw*01 (0.095)等,并且部分单倍型还呈现出显著的连锁不平衡。HLA-II类基因较为常见的单倍型有DRB1*15-DQB1*06-DRB5(0.137)、DRB1*09-DQB1*03 -DRB4(0.129)等,HLA-II类基因单倍型大都高度连锁,但单倍型种类远少于HLA-I类基因。汉族人群与世界其它人种间的HLA基因频率分布存在差异显著,且不同地区的汉族人群HLA基因频率分布亦差异显著。这些资料较系统地分析了我国汉族人群的HLA基因分布特征,为后续有重点的分析HLA分子空间结构差异与GVHD的关系等研究提供了可靠的遗传学资料。在获得汉族人群HLA-I、-II类基因多态性分布的基础上,我们从HLA分子空间结构差异的角度研究HLA结构与功能相容性。首先用SWISS-MODEL服务器对IMGT/HLA 2010年1月之前公布的HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DPB1、-DQB1位点4556个HLA分子逐一构建其空间结构;随后用计算机软件VMD计算各位点HLA分子两两间整体均方根偏差(RMSD),以此衡量HLA分子间空间结构差异的大小;并根据HLA分子结构特征,剔除非功能结构区域氨基酸残基差异对计算结果的影响,计算修正后分子间均方根偏差(RMSD-revised)。整理汇总160余万条数据后,我们编制了数据库管理工具,即人类白细胞抗原三维结构匹配打分系统-HLAStrucmark (v1.0),并于2007年获得国家计算机软件著作权登记证书。该打分系统不仅涵盖所有HLA分子间结构差异数据,而且融入了HLA序列比对功能及氨基酸残基特征展示功能,为HLA分子间结构与功能差异的分析提供了丰富、翔实和直观的数据。随后我们结合16例HLA不完全相合的临床HSCT资料进行分析,结果显示:RMSD或RMSD-revised值均同移植后排斥反应强度呈正相关;也就是说,供受者间错配抗原的结构差异较大,移植后将发生较为强烈的移植排斥反应;反之,错配抗原结构差异较小,移植排斥反应程度则较为轻微。但受限于现有临床病例数量,如果要获得可靠结论还需更大样本资料来进行回顾性分析。为进一步从分子生物学角度研究HLA分子空间结构差异大小与GVHD发生程度的联系,我们用CTL细胞的交叉识别格局来评价不同HLA分子间的相容性。我们成功设计并构建了中国汉族人群中常见的HLA-B*1502、HLA-B*1518、HLA-B*3503及HLA-B*4403分子重链的真核表达载体,并转染入HLA-I类分子缺陷性细胞株Hmy2.CIR。用转染后的Hmy2.CIR细胞分别体外负载低亲合力结合的EBNA肽,诱导活化T细胞使其成为具有相对抗原特异性的CTL。流式细胞术结果显示,刺激后CD8+T细胞亚群较诱导前显著增多,诱导前CD8+/CD4+比值为4:10,而经诱导后该比例倒置为10:7;TCR Vβ基因扫描显示,T细胞诱导前TCR Vβ各亚群呈典型高斯分布,诱导后T细胞有明显单克隆化形成。这说明经过低亲和力结合的HLA-EBNA肽复合体诱导,体外培养的T细胞出现了特异性CTL的增殖。随后采用T细胞增殖试验及细胞毒性试验鉴定异基因HLA-肽复合体诱导CTL的交叉识别能力。实验数据显示:HLA-B*4403诱导的CTL对B*1502、B*1518、B*3503诱导的CTL相互间交叉识别能力极弱,但B*1502、B*1518、B*3503诱导的CTL相互间却具有明显交叉识别现象,这说明HLA-B*4403相对于B*1502、B*1518及B*3503具有结构与功能不相容性。研究还分析了HLA-B*4403、B*1502、B*1518以及B*3503分子间结构差异,HLA-B*4403与B*1502、B*1518、B*3503分子在F抗原结合槽处存在多个氨基酸残基差异,这一方面佐证了F抗原结合槽对抗原呈递以及TCR识别有重要作用,另一方面也说明体外异基因诱导CTL的交叉识别格局可以用于HLA结构与功能差异的评价。以修正均方根偏差(RMSD-revised)表示分子间整体结构差异,结果表明,HLA-B*4403与B*1502、B*1518、B*3503的结构差异值比B*1502、B*1518、B*3503相互间的结构差异值大,表现出结构与功能上的独特性,进一步说明通过HLA三维结构差异评价HLA分子相容性有科学的实验基础支持。综上所述,本研究在国际上原创性地提出并完善了基于HLA空间结构差异评价HLA相容性,以优化选择最佳HSCT移植供者的新理论,并在临床HSCT患者中得到了初步证实;建立并完善了一种以CTL对异基因HLA交叉识别格局来分析HLA功能相似性的体外评价模式,该评价模式对研究HLA相容性提供了有效手段,为HLA相容性的理论研究与应用研究搭建一个科学、可行的体外技术平台,为今后HLA相容性研究提供可靠的量化数据。相信通过实验数据与临床移植病例资料的不断累积,定能绘制出完整的HLA分子相容性图谱,为异基因造血干细胞移植以及器官移植筛选最佳供者提供新思路和技术支撑。
【图文】：

区域图,采集整理,三维结构,分子

)区域图2-6. HLA-II分子RMSD计算(左)及RMSD-Revised计算(右)区域2.4 HLA三维结构数据库的采集整理及分析运算结果包括整体RMSD值及Revised值，后台数据用Microsoft OfficeAccess数据库软件管理，目前有160余万条记录。同时，我们用VC语言编制了数据库管理工具——HLAStrucMark系统，能够快捷简便的进行HLA-A、B、C、DRB1、DQB1、DPB1位点之间任意两个分子的整体均方差距离的查询。还能够展示HLA分子之间不匹配氨基酸残基的详细资料，如：在分子中所处的具体位置，在该位置的氨基酸的功能，是否处于锚定残基结合袋内，是否于呈递肽段结合以及是否与TCR结合等具体资料。这些资料在评价分子间的功能差异时，可以用作很重要的参考

后台,数据,位点,均方根偏差

201044图2-7A. HLAStrucMark系统及后台数据图2-7B. HLAStrucMark系统及后台数据2.5 HLA分子间均方根偏差分布整理HLA-A、-B、Cw、-DRB1、-DPB1及-DQB1位点计算的RMSD及RMSD-Revised数据，不同位点的结果分布各有特征，详见图2-8、2-9、2-10、2-11、2-12及2-13。各个位点修正后的RMSD值普遍减小，尤其是HLA-Cw位点较突出，而HLA-DRB1的计算结果经过修正后整体分布并没有太多改变。15.6%20.0%6.5%27.6%24.6%5.7%0
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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