EBV-LMP2重组痘苗病毒免疫效果研究

发布时间：2020-03-07 06:05

【摘要】：Epstein-Barr病毒（EBV）可引发多种疾病，鼻咽癌是其中之一，该病主要存在于东南亚地区，中国的发病率占世界的80%。目前，放疗和化疗是治疗鼻咽癌的主要方法，鼻咽癌尤其是中晚期鼻咽癌治疗失败多是由于局部复发和远处转移的原因，治疗后远处转移发生率约22%～36%。鼻咽癌细胞中EBV抗原的存在为免疫治疗提供了靶位，在鼻咽癌细胞中仅表达EBV核抗原1（EBNA1）、潜伏膜蛋白1（LMP1）、潜伏膜蛋白2（LMP2）三种病毒蛋白。其中，LMP2具有无致癌性、不引起B淋巴细胞的转化、具有潜在的HLA限制性细胞激活表位、能良好地诱导CTL、以及可以在鼻咽癌细胞中持续表达等优点，因此，LMP2是诱导特异性CTL、预防和治疗NPC的良好靶抗原。 痘苗病毒具有宿主范围广、插入外源基因片段长、多种途径进行接种、易于增殖生产等优点。改良型痘苗病毒株（MVA）是痘苗病毒安卡拉株经连续多次传代后获得的高度减毒复制缺陷型痘苗病毒株。其基因组发生了大量的缺失和突变，导致多个与宿主范围和致病性相关的基因功能的丧失。其除了具有痘苗病毒的一些特点以外，还具有安全性高、免疫原性好等优点，被广泛地应用到疫苗研究中。 由于病毒载体能产生很强的针对载体自身的中和抗体，限制了同一载体的反复使用。因此，曾毅院士提出了多载体序贯疫苗免疫策略。研究表明，序贯疫苗免疫能够很好地诱导特异性CTL免疫应答。 本论文以MVA作载体，成功构建了重组痘苗病毒MVA-LMP2，该病毒是复制缺陷型病毒。通过PCR、酶切鉴定及测序分析证明，大小相同，序列正确的LMP2基因准确插入到MVA载体中。RT-PCR、间接免疫荧光以及Western-Blot法检测结果表明，LMP2蛋白能够有效表达。本文重点评价了MVA-LMP2重组病毒在Balb/c小鼠体内所诱导的特异性CTL免疫应答水平。以肌肉注射的方法采用低（2×105pfu/只）、中（2×106pfu/只）、高（2×107pfu/只）三个不同剂量组，分别于0、2周免疫Balb/c小鼠，第3周用ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV-LMP2特异性CTL免疫应答水平。结果表明，三个剂量组的小鼠体内都可以产生针对LMP2的特异性细胞应答，随着免疫剂量的增加，所诱导的针对LMP2特异性细胞免疫应答增强。MVA-LMP2重组病毒高剂量免疫小鼠经LMP2多肽刺激后释放细胞因子IFN-γ的细胞最高可达437个/106脾淋巴细胞。间接免疫荧光检测MVA-LMP2免疫小鼠血清中抗LMP2特异性抗体。结果显示，MVA-LMP2可诱导产生特异性抗LMP2抗体。 另外，将本科室已构建的DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2、Ad5f35-LMP2与本课题组构建成功的重组痘苗病毒MVA-LMP2组成序贯疫苗，即DNA疫苗pVR-LMP2与腺病毒疫苗Ad5-LMP2两种载体组成的序贯疫苗；DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2以及Ad5f35-LMP2三种载体组成的序贯疫苗；DNA疫苗pVR-LMP2、腺病毒疫苗Ad5-LMP2与重组痘苗病毒MVA-LMP2所组成的序贯疫苗。免疫Balb/c小鼠，DNA疫苗免疫两次，腺病毒疫苗免疫两次，最后分别用Ad5-LMP2，Ad5f35-LMP2，MVA-LMP2加强免疫一次，末次免疫一周后取脾脏淋巴细胞，ELISPOT检测特异CTL水平。研究结果表明，Ad5f35-LMP2免疫组诱导的特异性CTL应答反应高于Ad5-LMP2免疫组，MVA-LMP2免疫组诱导的特异性CTL应答反应与前两者相比，免疫效果最好。经LMP2多肽刺激后，1×106个脾淋巴细胞可以释放细胞因子IFN-γ的细胞最高可达2694个。由此可见，DNA疫苗、腺病毒疫苗以及重组痘苗病毒疫苗所组成的序贯疫苗所诱导的特异性CTL的细胞应答效果最佳。
【图文】：

建了含有 EBV-LMP2 重组痘苗病毒 MVA-LMP2。整三步：首先是 MVA-LacZ 重组病毒的包装，其次是 n建，最后是 MVA-LMP2 重组病毒的获得。cZ 重组病毒的构建11 转染已感染了 MVA 病毒的 CEF 细胞后，，病毒基因K 区发生同源重组。获得重组痘苗病毒 MVA-LacZ。因，则会出现蓝色噬斑，否则为白色。图 A 为 MV在 X-gal 存在的情况下出现蓝色噬斑，图 B 为 MVA的条件下，没有出现蓝色噬斑。与预期结果相一致，毒。重组过程如图 2-1 所示。

图 A. MVA-LacZ 图 B. MVA 对照图 2-2 MVA-LacZ 病毒感染 CEF 细胞出现的病变Figure 2-2 detection analysis of CEF cells infected by recombinant virus of MVA-LacZ 穿梭质粒 pZL-1-LMP2 的构建及鉴定.1 neo 基因筛选系统 pZL-1 的构建 质粒 pSC11 去掉 lacZ 基因，并在此位大小约 800 bp 的 neo 基因。同时在启动子 p7.5 和 p11 之间插入大小约 190K 序列。如图 2-3 所示。pSC11ΔLacZ4813 bpAmpp7.5P11TKRTKLNeoTKL去除 LacZ 基因插入 neo 基因，TK 序列TKL
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2585322