RNAi技术沉默Ang2、Tie2基因抑制血管生成的体外实验研究

发布时间：2020-03-11 00:57

【摘要】： [目的] 1、构建体外血管生成的三维培养模型,研究体内人脐静脉内皮细胞(HVUECs)、体外培养的HVUECs和体外三维培养的血管样结构中促血管生成素1、2及其受体(Ang1、2及Tie2)的表达水平,旨在探讨其在体外血管生成中的作用。 2、探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默Ang2、Tie2基因使其在体外抑制血管生成的研究,为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。 [方法] 1、以酶消化法获得HVUECs,经免疫细胞化学染色技术鉴定,采用夹心培养法构建体外血管生成的三维培养模型,获得三维血管样结构。 2、采用逆转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法、免疫组化法和免疫细胞化学染色法分别检测10例体内HVUECs、体外培养的HVUECs及体外三维培养模型的血管样结构中Ang1、Ang2及Tie2的mRNA和蛋白的表达水平。 3、以Ang2、Tie2的mRNA已知序列为靶点,构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2.siRNA重组质粒各2条。 4、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒通过脂质体介导转染HUVECs,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测各组HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA及蛋白的表达状况。 5、应用体外血管生成的三维培养模型研究pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外形成血管样结构的情况。 [结果] 1、以酶消化法可获得以HVUECs为主的混合细胞悬液,经反复贴壁法分离纯化内皮细胞,采用免疫细胞化学染色技术对内皮细胞进行鉴定并确定了所纯化的细胞为HVUECs。采用夹心培养法成功构建了体外血管生成的三维培养模型,获得三维血管样结构。 2、体外三维培养模型中Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表达水平均高于体内和体外培养组(P＜0.05);体内和体外培养组之问Ang2、Tie2的蛋白及mRNA表达水平相比差异无显著性意义(P＞0.05)。 3、体内、体外培养及体外三维培养模型中Ang1的蛋白及mRNA表达水平相比差异无显著性意义(P＞0.05)。 4、成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,并且应用限制性内切酶HindⅢ进行消化,证实重组质粒不能被消化;测序结果与设计的完全相符。 5、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染HUVECs后,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,Ang2及Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P＜0.05),并且两个siRNA的2条重组质粒之间均无明显差别(P＞0.05)。 6、pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染后的HUVECs在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少(P＜0.05),表明血管生成受到明显抑制。 [结论] 1、夹心培养法是较为成熟的体外血管生成的三维培养方法,具有操作简便、三维血管样结构形成数量多、网络结构复杂等特点,适用于体外血管生成影响因素的实验研究。 2、Ang2、Tie2在体内和体外培养的HUVECs及体外三维培养模型的血管样结构中均有阳性表达,而Ang2、Tie2在三维培养模型中表达明显上调,表明Ang/Tie2体系在体外血管生成中起重要的作用。 3、成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒。 4、Ang2-siRNA、Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达,从而在体外抑制血管生成。
【图文】：

图3HI少压CsHE染色细胞涂片中内皮细胞呈圆形，胞核及核仁清晰可见(HE，HUVECs免疫化学染色鉴定结果分离纯化获得的翻叭咫Cs，经CD31、CD34、第姗因子染色显示，在浆有棕黄色颗粒沉着，三者在内皮细胞均为阳性表达(图4、5、6)。

HUVECs在4小时左右开始贴壁，形成单层多细胞集落，细胞呈梭形(图l);伴随细胞迅速生长，集落增大初长出的细胞为梭形，，一般5天左右融合成片，细胞互不重叠，呈单层铺路石状镶嵌排列，此时细胞呈多角形、梭形或卵圆形(图2);HE染色时，密集区细胞核呈椭圆形，染淡蓝色，密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞核呈梭形，着色深，呈紫蓝色(图3)。图l原代培养的扣盯压Cs在4小时左右开始贴壁，形成单层多细胞集落，细胞呈梭形 (x100)
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

【相似文献】

相关博士学位论文 前1条

1 王彪;RNAi技术沉默Ang2、Tie2基因抑制血管生成的体外实验研究[D];昆明医学院;2008年

相关硕士学位论文 前1条

1 林菊丽;pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建及其对体外血管生成的作用[D];福建医科大学;2009年

本文编号：2586162