抗EV71病毒VP2单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2020-03-10 02:11

【摘要】： 研究背景： 肠道病毒71型(Entero virus 71, EV71)感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑脊髓膜炎等多种疾病,并可引起严重的中枢神经系统并发症或致死性肺水肿。自1969年首次报道以来,EV71已经在世界范围内引起了十多次暴发流行,包括澳大利亚、东南亚和欧洲。众多血清型的肠道病毒在生物表现型与分子构成中具有相同的特性,因此其是否存在共同抗原及其位点存在于何处,已引起国内外众多的关注。衣壳蛋白在病毒感染及诱导机体免疫反应中起重要作用,国内外有许多研究致力于EV71衣壳蛋白及其抗体在基因分型和疫苗研制方面的应用。 研究目的： 制备能敏感且特异地识别EV71衣壳蛋白VP2的单克隆抗体,为今后临床检测EV71提供物质基础,并为EV71疫苗的制备及基础研究提供有力保障。实验方法： 以GenBank公布的EV71 VP2序列和参考文献为基础,利用计算机辅助设计,确定并人工合成抗原多肽,并用Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)交联以增强多肽的免疫原性。用合成的EV71衣壳蛋白VP2抗原多肽免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤融合技术和有限稀释法制备抗EV71 VP2单克隆抗体。将筛选获得的单抗细胞株注射BALB/c小鼠腹腔,收获腹水大量制备单抗,用亲和纯化法纯化抗体。采用ELISA法、免疫细胞化学染色法、免疫印迹Western-blot和免疫沉淀法(IP)鉴定单克隆抗体的效价、反应特异性和敏感性。 实验结果： 采用杂交瘤技术,获得4株针对人工合成的EV71衣壳蛋白VP2抗原多肽的特异性单克隆抗体。抗体亚类鉴定为IgGl型；用ELISA测定制备的单抗效价,纯化的单抗效价在1×105-1×106之间；免疫细胞化学染色法鉴定结果显示制备的单克隆抗体能够与EV71衣壳蛋白特异性地结合。以EV71病毒临床分离株为抗原,与纯化的单克隆抗体进行Western-blot和免疫沉淀分析显示,抗EV71衣壳蛋白VP2单克隆抗体与EV71临床分离株的制备蛋白反应后在相对分子质量约40KD处出现1条清晰条带,说明所制备的单克隆抗体可识别含有抗原肽靶位的EV71,证明制备的单抗具有良好的特异性。 结论： 本研究制备的抗EV71衣壳蛋白VP2单克隆抗体能敏感且特异地识别EV71衣壳蛋白。该抗体在今后EV71感染的诊断、治疗、疫苗制备、病毒的结构功能研究以及抗体分析等方面具有良好的应用前景。
【图文】：

生长至培养孔形成小的细胞集落。融合后第14天，细胞克隆迅速增大，，待克隆1/3面积时，可对所有克隆生长孔的培养上清进行检测(图3.1)。杂交瘤细胞克隆(第ro天)杂交瘤细胞克隆(第14天)图3.1融合后杂交瘤细胞生长状况(4x物镜观察)3.2杂交瘤细胞株建立以合成的 EV71VPZ抗原多肤免疫BALB/c小鼠，经融合后，共接种708孔，镜检长有杂交瘤的有398孔，杂交瘤形成率为56%。经ELISA筛选，从398孔中筛选到抗体分泌阳性孔124孔，对抗体分泌阳性孔进行克隆化培养。经过四次有限稀释后获得四株杂交瘤细胞株，分别命名为 0601DZ、060lH4、0601Aro和 0601B11，经ELISA鉴定每株的抗体阳性率均达到100%。图3.2为060lD2株第四次有限稀释的ELISA结果。

文体效价及亚类鉴定Ig亚类测定，结果如下(见表3.1)抗效价在lx1o，一lxl护之间。3.14株杂交瘤细胞纯化后单克隆纯化后抗体效价(lm岁mlxl05lxlO6lxl06lxl06
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：2585965