共刺激分子4-1BBL在口腔癌免疫治疗中的作用

发布时间：2020-03-12 04:21

【摘要】： 目的肿瘤细胞由于表面缺乏共刺激分子的表达,无法起始有效的抗肿瘤免疫应答,4-1BBL作为一种重要的共刺激分子,在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视,为了充分研究4-1BBL在肿瘤免疫中的作用,我们构建了人4-1BBL真核表达载体pEGFP-4-1BBL并转染口腔鳞癌细胞株,在体外与健康人外周血T淋巴细胞共同孵育,检测其在体外肿瘤免疫中的作用。探索建立人口腔鳞癌PBL-SCID鼠嵌合模型,进一步评价4-1BBL在人口腔鳞癌PBL-SCID鼠嵌合模型肿瘤免疫中的作用。方法(1)构建并鉴定真核表达载体pEGFP-4-1BBL,脂质体法将重组载体pEGFP-4-1BBL转染入人口腔鳞癌细胞Tca8113中,经G418(400μg/ml)筛选及有限稀释法后获得稳定高表达克隆,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达。通过丝裂霉素处理制备肿瘤细胞瘤苗。经体外与人外周血T淋巴细胞共同培养后,测定淋巴细胞特异性杀伤活性,T细胞增殖水平,T细胞分型及对淋巴细胞产生细胞因子白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)的影响。(2)SCID鼠右背部皮下注射5×10~5(0.2ml)Tca8113细胞。成瘤后随机分成4组,尾静脉注射anti-asialo-GM1多抗,其中第③组瘤内注射腺病毒空载体、第④组瘤内注射载有4-1BBL基因的腺病毒,随后②③④组小鼠腹腔注射健康志愿者外周血淋巴细胞(huPBL)3×10~7(0.5ml),第①组腹腔注射0.5ml1640培养基。每周记录各组小鼠成瘤情况,免疫重建后第2、7周取鼠血用ELISA法测定人IgG含量。小鼠处死后比较各组小鼠体重及肿瘤、脾脏的重量。RT-PCR检测4-1BBL基因在瘤体内的表达,HE染色观察肿瘤及脾脏生长情况。结果(1)RT-PCR及Western blot检测出转基因Tca8113细胞中4-1BBL的表达转染空载体pEGFP的Tca8113细胞中,没有检测到4-1BBL的表达。经过G418筛选后有限稀释法建立了4-1BBL/Tca8113细胞株。经MMC处理后,与未转染的Tca8113细胞相比较,转染人4-1BBL的Tca8113细胞能够显著增强T细胞增殖,促进IL-2、IFN-γ分泌,并能有效地诱导CTL产生对Tca8113细胞的特异性杀伤作用。(2)模型成瘤率为100%,成瘤潜伏期12～18天。免疫重建后第2、7周时人口腔癌PBL-SCID嵌合组小鼠血中人IgG分别达(71.8±13.2)μg/ml、(136.9±15.3)μg/ml。免疫重建及转染4-1BBL基因组小鼠,肿瘤生长受到明显抑制(p＜0.01)。冰冻切片在倒置荧光显微镜下图像及RT-PCR证明4-1BBL基因在瘤体内充分表达,冰冻切片HE染色见肿瘤生长、脾脏有大量淋巴细胞浸润。结论转染4-1BBL基因既能增强口腔鳞癌细胞Tca8113的免疫原性,亦能诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答。SCID小鼠皮下注射口腔鳞癌细胞、尾静脉注射anti-asialo-GM1多抗及腹腔注射人淋巴细胞可建立人口腔鳞癌PBL-SCID嵌合模型,经腺病毒转染4-1BL基因后,可显著提高宿主对瘤体的抑制作用。
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392;R739.8

【参考文献】