HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD三种蛋白胞外区抗原性分析及克隆表达、纯化鉴定

发布时间：2020-03-12 07:03

【摘要】： 单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)是危害人类健康的常见病原体,其感染发病率高,且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV有1型(HSV1)及2型(HSV2)两型,HSV1主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等;HSV2主要引起生殖器感染,并且和女性宫颈癌的发生密切相关。目前国内外无HSV疫苗,在积极研制。HSV包膜蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激机体产生免疫应答及疫苗研制中具有重要地位,其中gB蛋白和gD蛋白能诱发特异性应答,具有重要的抗原表位,是宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶标之一,因此gB、gD蛋白是构建HSV疫苗的理想抗原。本研究分析筛选HSV1 gD、HSV1 gB、HSV2 gD三种蛋白的抗原表位,利用基因工程技术表达三种蛋白,为研制重组HSV1型及2型二价疫苗奠定基石出。通过对HSV1 gB、gD及HSV2 gD三种蛋白的抗原表位分析,筛选三种蛋白含强抗原决定簇较集中的胞外区片段,选用真核和原核细胞均偏爱的密码子,并对设计基因的RNA结构进行优化,化学合成HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信号肽序列的基因序列。以化学合成的HSV1 gB、HSV1 gD、HSV2 gD含信号肽序列的胞外区基因序列为模板,用PCR方法扩增HSV1 gB、HSV1gD、HSV2gD胞外区1～696aa1l～284aa、1～284aa的基因片段,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-2内,获得的重组质粒转化大肠杆菌TG1,IPTG诱导表达及SDS-PAGE鉴定分析。表达的HSV1gB/GST、HSV1 gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白分子量分别为96kd、56kd、56kd。利用亲和层析方法,纯化获得可溶性重组HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD蛋白。将纯化获得的融合蛋白HSV1gB/GST倍比稀释,用Human HSV1ELISA试剂盒检测表达蛋白HSV1gB/GST的抗原性。将纯化获得的HSV1gD/GST、HSV2gD/GST融合蛋白倍比稀释,用HRP标记的HSV1+HSV2抗体检测表达蛋白HSV1gD/GST、HSV2gD/GST的抗原性。结果显示,表达的三种融合蛋白具有较好的抗原性和特异性。将纯化后的重组表达蛋白HSV1gD/GST用凝血酶切去GST标签后作为抗原免疫新西兰白兔,取兔耳缘静脉血用间接ELISA法检测抗HSVgD1抗体效价≥1:64 000。表明重组表达蛋白HSVgD1有良好的免疫反应性。以化学合成的HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD含信号肽序列的胞外区基因序列为模板,PCR扩增HSV1gB、HSV1gD、HSV2gD胞外区含信号肽序列1～706aa、1-314aa、1-314aa的基因片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)内,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,Western Blot分析检测目的蛋白在胞内和胞外的表达。结果显示,表达的HSV1gD、HSV2gD蛋白在胞内及培养上清内均存在,而HSV1gB蛋白未表达。合成HSV1gB蛋白基因不表达提示,在真核表达系统中,基因的RNA二级结构比密码子使用频率更重要。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,产物,转化子

1Hsvl一gB、Hsvl一gn、HsvZ一:oNAmarker(DL2000，几KaHsVI一gDpCR产物:3:HSVI一gB的构建与鉴定构建的HSV1gB、HSv1gD、个BamHI酶切位点，3’I与EcoRI对纯化的P连接，将连接后的重组转化子。重组质粒的构建)。

重组质粒,菌液,转化子,片段

图2pGEx一4T-ZIHSvl一叨重组质粒的构建(二)重组质粒的筛选与鉴定在LB培养基平板上涂布重组质粒菌液，37℃过夜培养，随机挑取6个转化子菌落，同时另外挑取1个阴性对照菌(含pGEX一4T-2空质粒)，分别接种培养后进行如下鉴定分析。1.PCR鉴定以上述转化子为模板扩增的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(设阳性对照)。HSvlgB一pGEX一4T-2重组质拉的6个转化子均扩增出目的基因片段(Z107bp)，阴性对照菌未扩增出基因片段。其中2、3、4号条带较亮，l、5、6号条带较淡(图3)。Hsvl叨一p伍x一4不2重组质粒的6个转化子均扩增出目的基因片段(873饰)，阴性对照菌未扩增出基因片段。其中1、5号条带较亮，2、3、4、6号条带较淡
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】