血栓性疾病及抗栓基因工程抗体的分子生物学研究

发布时间：2020-03-20 22:33

【摘要】： 血栓性疾病的发生是由多种遗传和环境因素共同作用的结果。vWF是由血管内皮细胞和巨核细胞合成的多聚体糖蛋白，既可在高切状态下启动血小板粘附、聚集，又是携带凝血因子Ⅷ的载体，最近的许多体外实验证据显示，vWF在血栓形成中起着关键性作用。研究表明，vWF是一般人群中经常发生的心肌梗死的危险因素，vWF基因启动子区域的-1051G／A、-1792C／G等多态性可通过调节血浆vWF水平而与缺血性心脏病的发生密切相关，vWF多肽序列中Thr789Ala多态性也是Ⅰ型糖尿病病人中冠心病发生的一个危险因素。因而有理由将其作为血栓形成的候选因子进行研究。基因芯片技术已在基因测序，基因突变及多态性分析，基因表达及功能分析，文库筛查，新药开发以及病原体检测等方面进行了应用和探讨，呈现出广阔的应用前景。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是遗传变异中最常见的一种变异方式，在人类基因组中其发生频率为每1000bp中0.5-10个。由于多基因与环境间具有十分复杂的相互作用，必须对人群中大量出现的SNP进行确定，才能对它们在疾病发生发展中的作用进行解释。本研究拟探讨vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性与血栓性疾病的发生有无相关关系；并对基因芯片技术在SNP检测上的应用进行探讨。 研究中，我们首先建立vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性寡核苷酸阵列检测方法。设计、合成两组寡核苷酸探针，使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化学物质，实现探针与固相支持物玻片的连接。应用不对称PCR方法扩增RsaⅠ、SmaⅠ多态性片段，在扩增体系中掺入荧光标记dUTP，获得被测片段的单链标记产物。对核酸杂交反应的温度、动力学和离子浓度变化进行研究，获得最佳的杂交鉴别条件，随机抽取20名正常人，酶切法确定多态性基因型，再用寡核苷酸阵列法检测，以验证该方法的准确性。使用该方法对50例血栓病人进行检测，，探讨血栓性疾病的发生与vWF基因RsaⅠ、SmaⅠ多态性的关系。结果表明，寡核苷酸阵列法和酶切法对20例标本检测的符合率为100％；血栓病人与正常人之间两位 苏州大学傅士学位论文 中文摘要 点多态性的基因型和等位基因频率的差异均无显著意义（P＞0．05）。因而本研究 成功建立 vWF基因 Rsa、Sma多态性寡核苦酸阵列检测方法，为基因芯片技 术在SNP检测上的应用提供依据；同时也对遗传性疾病的高效诊断途径进行了成 功探索；未获明确证据表明Rsa、Sma多态性与血栓的发生有关。 上述研究中，虽然50例血栓病人与正常人之间Sma多态性在基因频率与 基因型分布的差异上无显著统计学意义，然而 Sma阳性纯合子在血栓病人中的 出现频率为正常人的2．7倍。为弄清这一多态性对血栓发生的确切影响，我们扩 大样本例数，并使用价格低廉的聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析 （PCR－RFLP）技术代替寡核苦酸阵列检测方法，对107例急性脑梗死（脑梗）、 49例急性心肌梗死（心梗）病人和 113例正常对照，检测 vWF基因 Sma多态 性，并对其中来自同一医院的53例脑梗、22例心梗病人和47例正常对照进行 血浆 vWFkg测定。结果，vAF基因 Sma多态位点各基因型和等位基因分布， 在脑梗病人与正常对照组间差异有显著意义①．OD户0．om；O．05＞户0．02人其 中 S。al阳性纯合子（CC）使患脑梗的危险度提高了 3．29倍（0R＝＝3．29 95％CI： ，1．5个7．01，0．m坝0．001人心梗病人与正常对照组间各基因型和等位基因分布 差异无显著意义（0．50＞p）0．30；0．30＞p＞0．20）。血浆 vWFhg测定结果为，正常 人及脑梗、心梗病人血浆 VWFkg水平分别为 0．468、0．584和 0．783U砌l。脑梗 病人与正常对照间无显著性差异（peo．195人而心梗病人与正常对照间有显著性 差异（p＝0．00人 v呷基因 Sma多态位点各基因型分布在脑梗、心梗病人和正 常人各组中与血浆VWF Ag水平均无相互关系（P＝0．323，P＝0．315，peo．96人表 明，vWF基因Sma多态性与脑梗发病相关，可能是脑梗发病的危险因素之一； 未发现与急性心肌梗死发病相关；该多态位点与血浆 vWFkg水平无关。 血小板在血栓形成尤其是动脉血栓形成中起着十分重要的作用，选择适当 抗体、蛇毒、合成肽等物质，有效抑制血小板的功能，己成为研制新型抗血栓药 物的有效途径。其中以抗 GP 11b／Illa单克隆抗体 7E3为亲本制备的人－鼠嵌合抗 体hab片段C7E3，能显著降低急性冠脉综合症PTCA术后再梗塞和缺血并发症的 。发生率，已获FDA批准，广泛应用于缺血性心脏病患者的治疗。SZ《是我室制 备的一株针对 GPIb a的单克隆抗体，其抗原表位位于 GPIb a Try276－Gin282，不 仅具有抑制瑞斯托霉素、博托?
【图文】：

由图1、2可见，Rsal、Sma工均由三条带组成(最前面模糊条果各组探针序列见表1。表中Rsal阴性序列，因此如果标记单a工阳性纯合子;如果标记单链性纯合子;如果可同时与RPI、R中SPI用于检测Sma工阴性序别检测出Smal阳性纯合子、阴性条件研究中的对照，同时也对4在未知序列测定中的应用提供依

ma工片段荧光标记扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳标记片段.4.DNAMarker:100bpLadder.5.Sma:)3一N二CH一(CHZ)3一CH二N一(CHZ)。一O一P一O一TTTTTTTTTTTTTTTG图3寡核昔酸探针与玻璃支持物表面的连接力学研究结果:杂交信号随杂交反应时间的延大(1461bp)，与探针结合后所产生的空间位阻也而Smal片段随时间的增长强度低于RSal片段(3
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

【参考文献】

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1 安广宇,董宁征,阮长耿;抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21基因克隆及单链抗体的构建和表达[J];免疫学杂志;2001年03期

2 刘晓健,安广宇,董宁征,邵波静,阮长耿;抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体抑制兔血栓形成的实验研究[J];江苏医药;2001年04期

3 阮长耿,盛茗;基因多态性研究与血液病[J];中华医学杂志;2000年09期

本文编号：2592296