小鼠重组糖调节蛋白78诱导DC的生物学特性研究

发布时间：2020-03-23 08:48

【摘要】：[背景与目的] 葡萄糖调节蛋白78(Grp78)是内质网中的分子伴侣,是热休克蛋白70家族的成员之一,Grp78参与未折叠蛋白反应(UPR),在维持细胞内环境的稳态方面发挥十分重要的作用。应激状态下,如感染、缺氧、营养剥夺、毒性物质刺激等,Grp78在内质网中的表达有助于蛋白质分子的正确折叠,维持内质网稳定；细胞核及胞浆中的Grp78可促进抗凋亡分子的表达,阻止凋亡级联反应。课题组前期工作证明,增加Grp78在胰岛p细胞的表达不仅可以保护胰岛p细胞抵抗凋亡,同时还可诱导免疫负调T细胞的形成,参与免疫调节,但免疫负调T细胞诱导形成的机制尚不清楚。但由于Grp78蛋白本身并不具备跨膜区域,因此推测Grp78也可能被转运至细胞膜外,以分泌型的形式表达。2009年,Kern J等在研究bortezomib的抗血管生成作用时发现,多种实体瘤细胞系,如MCF-7、PC-3、HRT-18等,能分泌一种可溶性因子保护内皮细胞抵抗bortezomib的损伤,经分析证实该可溶性因子正是Grp78。说明在应激状态下,细胞不仅提高Grp78的胞内表达抵抗凋亡,同时还能将Grp78分泌至胞外微环境中,调节周围细胞的功能。近年来,有研究报道分泌型Grp78可以影响树突状细胞(DC)的发育。DC是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞(APC),在免疫应答及启动抗肿瘤免疫反应中均起着关键作用。人体内DC处于不同成熟状态,未成熟DC表达低水平的共刺激分子和粘附分子,提呈抗原能力较弱,体外激发同种混合淋巴细胞反应的能力较低；但未成熟DC具有极强的抗原吞噬能力,在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时可分化为成熟DC,刺激T细胞,诱导免疫正应答。前期课题组研究发现过表达Grp78具有免疫负调作用,其作用是否通过调节DC的成熟参与负调T细胞功能尚待探讨。基于此,本博士学位论文课题研究在前期纯化获得小鼠重组Grp78的基础上,分别将LPS和Grp78添加至BMMC培养体系中,探讨Grp78对BMMC诱导分化以及DC生成分化成熟的影响,并进一步鉴定其生物学功能,旨在为深入研究Grp78在免疫调节中的作用奠定基础。 [方法] 1.Grp78的表达与纯化将课题组已构建的pGEX-4T-3-Grp78质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导大量表达,提取可溶性蛋白,通过GST Spin Purification Kit纯化,将收集的目的蛋白放入30KB的超滤管中,3000G10min,加入10mlPBS多次离心,用BCA试剂盒检测蛋白浓度后,-80℃保存备用。 2.小鼠骨髓来源DC的诱导培养从Balb/c小鼠股骨中分离骨髓来源的单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells, BMMC),加入约16ml完全培养基(1640+10%胎牛血清),轻轻吹打混匀,转入24孔培养板中,2ml/孔,添加青霉素/链霉素,终浓度为100U/ml, GM-CSF终浓度10ng/ml, IL-4终浓度10ng/ml,37℃,5%CO2温箱培养7天,流式细胞术检查CD11c分子的表达。 3. LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC的诱导培养上述诱导培养的DC每2天半量换液一次,并设立不同实验组：①Control组；②LPS组：第7日弃上清加1ml培养基,加入LPS(终浓度500ng/ml)刺激12h后收获细胞,命名为LPS-DC;③Grp78组：培养第1天开始加纯化的rmGrp78蛋白(终浓度10μg/ml),命名为Grp78-DC;④Grp78+LPS组：第1天开始加纯化的mGrp78蛋白,并于第7天换液加LPS,刺激12h后收获细胞,命名为Grp78-LPS-DC。上述各组于第3日,第5日半量换液,第7日弃上清加约1ml培养基。 4.小鼠骨髓来源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面标志的检测取上述培养的细胞,采用流式细胞术检测CDllc+细胞表面I-A/E、 CD80/CD86、CD83、CD40、B7-H3/4等分子的表达。 5.不同组诱导小鼠BMMC分泌细胞因子的检查收集上述各组细胞培养上清,采用ELISA检测TNF-α、IFN-γ、IL-10等细胞因子的分泌。 7.不同组诱导小鼠BMMC分泌HMGB1、NO的检查收集上述各组细胞培养上清,采用ELISA检测HMGB1、NO的分泌。 8.小鼠骨髓来源不同组DC培养后葡聚糖摄取能力的鉴定取上述培养的细胞,加入PE-dextran,37℃孵育1h,采用流式细胞术检测CDllc+细胞葡聚糖摄取能力。 9.不同组诱导小鼠BMMC培养后COX-2、ARG1、iNOS等分子mRNA的检测从Balb/c小鼠中分离BMMC,于第8日相应组加入LPS后5h收获细胞,提取mRNA,逆转录后,采用RT-PCR检测细胞内COX-2、ARG1、iNOS等mRNA的表达。 10.不同组诱导小鼠BMMC培养后细胞因子mRNA的检测从Balb/c小鼠中分离BMMC,于第8日相应组加入LPS后5h收获细胞,提取mRNA,逆转录后,采用RT-PCR检测细胞内TNF-α、TGF-β、IL-6、iNOS、 IL-10、IL-4、IL-12等因子mRNA的表达。 11.不同组小鼠BMMC诱导脾脏来源T细胞的特征分析将收获的各组BMMC与同系小鼠脾脏来源的T细胞共培养(BMMC:T细胞=1：10),培养体系中添加IL-2(200U/ml)、抗小鼠CD3单克隆抗体(0.3μg/ml),共培养5天后,采用流式细胞术比较各组CD4+细胞中CD25+Foxp3+细胞百分比差异。 12.不同组诱导DC输注小鼠体内诱导T细胞特征分析用NIT细胞负载Grp78诱导的BMMC,磁珠分选CDllc+细胞,然后输注Balb/c小鼠(5×106细胞／只),每周一次,共3次,最后一次输注后10天,处死小鼠,取淋巴结、血液中淋巴细胞,分析CD4+细胞中CD25+Foxp3+细胞百分比;取脾脏中淋巴细胞分析CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+IL-17+T, CD4+IL-4+T, CD4+IL-10+T及CD4+IFN-γ+T细胞百分比。 [结果] 1.Grp78对BMMC诱导分化的影响与对照组相比,Grp78的添加能显著抑制BMMC分化为CDllc+细胞(P=0.003),且随着Grp78浓度的升高,CDllc+细胞比例逐渐降低,呈剂量依赖性；进一步采用流式细胞术检测细胞表面CDllb与Grl标志,结果显示Grp78组以及Grp78+LPS组髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)形成的百分比升高,且随着Grp78浓度的升高,MDSC比例逐渐升高。提示Grp78参与负性调节作用与抑制CDllc+细胞分化及促进MDSC形成有关。 2.鼠骨髓来源LPS-DC, Grp78-DC,Grp78-LPS-DC表面I-A/E分子的表达结果显示Grp78-DC、Grp78-LPS-DC表面的I-A/E表达较LPS-DC表达明显下降(P0.01)。 3.小鼠骨髓来源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面分子的表达与LPS-DC相比,Grp78-DC, Grp78-LPS-DC表面DC活化标志分子CD83的表达显著降低(P=0.011),同时共刺激分子CD40、CD86的表达下调,而共抑制分子B7-H3、B7-H4的表达上调; 4.不同组诱导小鼠BMMC细胞因子的表达 Grp78诱导的BMMC的NO分泌降低,HMGB1、TGF-β分泌无影响；在mRNA水平,Grp78诱导的BMMC中COX-2的表达降低。 5.不同组诱导小鼠BMMC培养后细胞因子的表达 Grp78诱导的BMMC分泌IL-10增加,IFN-γ、TNF-α分泌降低,TGF-β分泌无影响；在mRNA水平,Grp78诱导的BMMC降低炎性因子TNF-α的表达。 6.小鼠骨髓来源LPS-DC, Grp78-DC, Grp78-LPS-DC葡聚糖摄取能力 Grp78-DC和Grp78-LPS-DC摄取葡聚糖的能力显著高于LPS-DC, Grp78诱导的CDllc+细胞对于葡聚糖的摄取率增加13%,提示Grp78诱导CD11c+细胞维持葡聚糖的强摄取能力。 7.小鼠BMMC诱导脾脏来源T细胞的特征与同系小鼠脾脏来源的T细胞共培养,Grp78诱导的BMMC能诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞生成,比率明显高于对照组(P=0.009)。 8.小鼠骨髓来源不同组DC分别输注小鼠体内诱导T细胞特征 NIT冻融物负载各组CDllc+细胞输注Balb/c小鼠,处死小鼠后,取脾脏、淋巴结、血液中淋巴细胞,分析T细胞的特征。结果显示,淋巴结内小鼠CD4+T细胞的百分比无明显差异,Grp78-DC输注组CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分率明显增加(P0.05)；血液中各组小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞的百分比无明显差异(P0.05),脾脏中各组小鼠CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+IL-17+T, CD4+IL-4+T, CD4+IL-10+T及CD4+IFN-γ+T细胞的百分比无明显差异(P0.05)。 [结论] 本课题首次探讨了Grp78对小鼠BMMC诱导分化的影响,以及对骨髓来源DC分化成熟的影响,并初步探讨了其功能,通过与Control组、LPS诱导组比较,研究结果表明：①Grp78抑制BMMC向DC分化,而促进向MDSC分化,其作用可能与Grp78免疫负性调节功能有关；②Grp78诱导的CD11c+细胞仍维持较强的抗原摄取能力,但细胞表面I-A/E分子及共刺激分子的表达下调,共抑制分子表达上调；炎性因子分泌降低,IL-10分泌增加；提示Grp78诱导的CD11c+细胞具备耐受性DC的表型；③与同系小鼠脾脏来源的T细胞共培养,Grp78诱导的BMMC诱导具有Treg细胞特征的细胞明显高于对照组；④体内实验证明,Grp78-DC输注,小鼠淋巴结内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著高于其他DC组,上述结果提示Grp78-DC和Grp78-LPS-DC具有耐受性DC特征。
【图文】：

细胞的,细胞,百分比

华中科技大学博士学位论文 C：不同浓度Grp78对BMDC分化为CD】lc+细胞影响的统计分析结果(**:P<0.01, *： P<0.05, NS： P>0.05,本实验重复 5 次）由上述结果可见，Grp78可抑制BMMC向CDnc+细胞分化。为了研究Grp78对其它抑制性细胞，如MDSC分化的影响，进一步采用流式细胞术检测Grp78诱导后的BMMC细胞中CDllb+Grl+细胞百分比，结果显示随着Grp78浓度的升高，CDllb+Grl+细胞百分比逐渐升高，提示Grp78可促进BMMC向CDllb+Grl+的MDSC方向分化（图1-2), MDSC的形成可能与Grp78参与负性调节作用有关。A

共抑制,共刺激分子,细胞表面

图3 Grp78处理的CD11C+细胞表面共刺激分子表达降低并共抑制分子的表达升高Figure 3 Grp78 can reduce expression of costimulatory molecules and enhanceexpression of inhibitory molecules on CDllc+ cells.图3A:不同组CDllc+DC表面共刺激分子和共抑制分子表达FCM图图3B:不同组CDllc+DC表面共刺激分子和共抑制分子表达统计分析结果（**:/'<0.01, *： P<0.05, NS： P>0.05,本实验重复 5 次）四、不同组诱导小鼠BMMC细胞因子的表达收集上述各组细胞培养上清，懫用ELISA检测TNF-ot、IFN-y> IL-10、TGF-p等细胞因子的分泌，图4结果显示Grp78处理的BMMC可增加IL-10分泌（/><0.05)，降低TOF-a的表达（PCO.Ol),对IFN-y、TGF-p的表达无显著影响。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【共引文献】