猪内源性逆转录病毒异种移植生物安全性的初步研究

发布时间：2020-03-23 23:06

【摘要】： 猪器官、组织和细胞作为临床移植的供体源具有广泛和良好的前景，可缓解临床器官移植的器官相对短缺，也可为临床治疗Ⅰ-型胰岛素依赖型糖尿病，帕金森病、亨廷顿病、癫痫病等顽固性神经疾患提供一种治疗方法，并可作为治疗急性爆发性肝炎肝功能衰竭、急、慢性肾功能衰竭的过渡性措施。自Dr．Clive Patience(BioTransplant Inc．首席科学家)1997年报道猪内源性逆转录病毒(PERV)感染体外培养人细胞以来，猪异种移植过程中可能发生PERV种间传播的潜在危险已引起众多学者的广泛关注。 Patience等首先证实至少有三个PERV亚型在体外培养能感染人细胞，Takeuchi等通过假型实验也证实PERV感染体外培养人细胞株，Martin等通过感染性实验证实了PERV感染体外培养人细胞。以后许多学者从多方面对PERV的生物学特性进行了较为广泛和深入的研究。 目前已经证实猪内源性逆转录病毒为典型的哺乳动物C型逆转录病毒，并具有gag-pol-env基因组结构。Patience等从两株猪肾细胞株分离得到的天然病毒粒子，证实为典型的哺乳类C型逆转录病毒。Akiyoshi等鉴定小型猪淋巴细胞PERV(PERV-MSL)全长cDNA核酸序列，证实PERV-MSL是一种典型的C型逆转录病毒，其长度为8132bp，与长臂猿白血病病毒和鼠白血病病毒具有最大的核酸序列同源性。同时在多种猪器官和正常白细胞检出PERV-MSL RNA的结构产物。PERV-MSL的gag、pol、env的ORF氨基酸序列与Tsukuba-1逆转录病毒氨基酸序列的同源性＞99％，与胎猪肾细胞PERV(PK15-PERV)氨基酸序列具有高度同源性。我国猪种资源丰富，国内尚未开展猪内源性逆转录病毒生物学方面的实验研究。 体外实验已经证实了猪PERV对人细胞具有感染性，但在体感染性研 究报道甚少。Van der Laan等通过建立非肥胖性糖尿病／严重联合免疫缺陷 wOD用CID鼠胰岛细胞移植模型，首先证实猪胰岛细胞产生PERV，并在 体外培养感染人细胞，并移植至NOD侣 鼠，检测鼠组织PEM RNA 的表达，结果发现多种组织发生PERV感染，这是移植猪组织后体内PERV 主动复制，也是在体种间交叉感染的首次报道。后来Deng等建立SCID鼠 移植胎猪胰岛细胞模型，将胎猪胰岛移植于 SCID鼠，饲养 3＊ 周分别处 死。取肝、脾、脑提取 DNA和 RNA，应用巢式 PCR和 RTPCR检查 PEM 和扩增猪线粒体细胞色素氧化酶亚单位＊基因o），结果发现M4－肝和 M19－脾组织的PERV阳性，COil阴性，这提示猪PERV向鼠组织传播己经 发生，但检测 PERV RNA未发现鼠组织有活跃的 PERV复制的证据。这些 结果初步表明猪细胞可以在体感染鼠组织。而近期有几宗接受活猪组织或 细胞移植的临床病例的文献报道，但所有报道均表明未发现PERV感染的 证据。临床结果与实验结果并不完全一致，因此PERV的在体感染性尚末 到广泛的公认，有待进一步深入研究。 为此，本课题拟从猪外周血白细胞基因组存在的PERV基因序列及其 差异性、各种猪组织PERV基因序列的mRNA丰度、猪皮肤成纤维细胞 对人HEK293细胞的体外感染性和对SCID鼠的在体感染性入手，研究我 国猪PERV的生物学特性、猪组织PERV的表达的高低幅度（高表达和低表 达）及猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性，从而为猪－人间异种 移植积累资料，为临床应用提供实验依据，为异种移植的生物安全性评价 奠定基础。研究内容分为以下三部分：＊）猪外周血白细胞DNA猪内源性 逆转录病毒序列的检测及差异性分析。主要了解我国猪资源的PERV生物 学特性，，为猪异种移植积累资料。p）两种小型猪不同组织 PERV m洲A 丰度及其差异分析。了解备种组织PERV表达情况，以寻找PERV高表达 和低表达器官或组织，为临床猪异种移植选择组织或器官提供实验依据。 O）猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性实验研究。通过实验了 解猪皮肤成纤维细胞PERV的对人HEK293细胞的体外感染性和对SCID 鼠的体内感染性，为猪异种移植提供实验依据。 ·x· 本研究应用PCR、PCR－RFLP、SS－SSCP等技术分析12个品系猪外周 血白细胞基因组DNA的PERV基因序列片段及其差异，应用RT－PCR方 法分析广西巴马小型香猪和贵州小型香猪13种组织P＊RV基因序列m RNRNA 的表达及其差异，应用组织细胞培养方法、免疫组织化学、电镜技术建立 和鉴定猪皮肤成纤维细胞系，并将猪皮肤成纤维细胞与经过转染的具有抗 新霉素基因的人neo／HEK293细胞共培养，或将猪皮肤成纤维细胞移植于 SCID 鼠，探讨猪内源性逆转录病毒的体外和体内感染性，获得以下结果 和结论： 1．口个品系猪外周血白细胞 DNA池基因组普遍存在 PERV－A、 PERVI、PERV gag基因序列，分析各品系个体发现PERV（基因序列的 检出率约为 10％。应用逆转录病毒逆转录酶基因高度保守区序列为引物， 寻找新的逆转录病毒序列，未能发现新的逆转录病毒序列；应用SS七SCP 技术分析 12个品系猪外周血白细胞基因组扩增产
【图文】：

PMpL4FM3FM7FL:0PKCNM1543b黑5]sbP337bl)237bp图版21皮下移植猪细胞SCID鼠组织DNACOH基因序列片段检测K一15细胞2#鼠肌组织pL4:注射pK一15细胞4州鼠肺FM3:注射pSF细胞3#鼠肌7#鼠肌组织FLI。:注射PsF细胞l。#鼠肌组织PK:PK一15细胞M:PC训alkerCPHIPSZFH，FKZFS;FL;FSSFH6FX7FKsFKgFH一oCNM
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R363

【引证文献】

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1 张立;猪内源性逆转录病毒分子特性的研究及抗病毒位点的选择[D];四川大学;2007年

本文编号：2597402