结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核杆菌感染的保护作用

发布时间：2020-03-24 11:36

【摘要】： 目的： 本研究拟从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ag85b、mpt64以及引入甘氨酸接头连接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），构建DNA疫苗并探讨其在小鼠体内诱导的免疫应答和在小鼠结核感染模型中的保护作用，为新型结核病疫苗的研制奠定基础，同时也为结核病的免疫防治提供理论和实验依据。 方法： 1、用PCR和基因克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B、MPT64编码基因以及通过甘氨酸接头连接的Ag85B-MPT64融合基因（AM），构建真核表达质粒pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM，用酶切和双向DNA测序进行鉴定； 2、将MPT64、Ag85B编码基因亚克隆入pET32a中，构建pET/Ag85B和pET/MPT64原核表达质粒，使其在大肠杆菌中表达并鉴定。用重组的MPT64和Ag85B蛋白免疫BABL/c小鼠， 制备MPT64 WP=9 与Ag85B抗血清。 3、将pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹的方法鉴定融合基因的表达。 4、用质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM（经过限制性内切酶消化后粘粘连接的Ag85B-MPT64融合基因）免疫C57BL/6小鼠，采用 ELISA法测量免疫后相应的PPD特异性抗体和脾淋巴细胞IL-4 以及IFN-γ分泌水平；MTT法检测PPD特异性脾淋巴细胞增殖能力。 5、以重组质粒免疫C57BL/6小鼠，末次免疫5周, BCG免疫100天后，用经过动物体内恢复毒力的1×106CFU MTb.H37Rv标准株由尾静脉注射攻击，以PBS组和空质粒组作阴性对照、BCG组作阳性对照；6周后分批处死动物，测量PPD特异性抗体、PPD特异性脾淋巴细胞IL-4和IFN-γ分泌水平；观察肺和脾组织器官荷菌量、组织抗酸染色、病理学改变以及小鼠存活时间。 结果： 1、经过限制性内切酶酶切及DNA双向测序证实 pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B序列与理论值一致，，pcDNA/AM碱基突变率为0.11%（2/1707），突变为无意义突变。 2、将MPT64、Ag85B编码基因亚克隆入pET32a原核表达质粒中，构建的pET/ MPT64和pET/Ag85B在大肠杆菌中表达了具有生物学活性的重组MPT64和Ag85B蛋白。用重组蛋白制备的鼠抗 WP=10 MPT64与Ag85B血清效价分别为1:32和1:64。 3、重组质粒转染COS-7细胞后，分别用MPT64、Ag85B多克隆抗体通过ELISA法检测细胞培养上清液，抗MPT64与pcDNA/MPT64、抗Ag85B与pcDNA/Ag85B呈阳性反应，pcDNA/AM组与抗MPT64和抗Ag85B均呈阳性反应；对照组均为阴性反应。 4、将PBS、pcDNA3.1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/AM和pcDNA/BM免疫C57BL/6小鼠，末次免疫4周后，实验组PPD特异性抗体水平均有不同程度增高，以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM组最高（P0.05）；脾淋巴细胞经过PPD刺激后， IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM组和pcDNA/BM组明显高于其他组（P0.05），pcDNA/AM组高于pcDNA/BM组（P0.05），pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64组与pcDNA/AM组之间差异无显著性（P0.05）。 5、用H37Rv标准株攻击小鼠后6周，BCG、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/BM和pcDNA/AM组IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力均有不同程度增高，以BCG组最高，pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM组次之，pcDNA3.1和PBS组最低，但pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM组的差异无显著性（P0.05）。各组均未检测到IL-4的分泌。 6、肺、脾荷菌量以BCG组最低（P0.01），混合质粒组和AM免疫 WP=11 组次之；但混合质粒组和AM免疫组之间差异无显著性（P0.05），AM与BM DNA免疫组之间有显著性差异（P0.05）。 7、用H37Rv标准株攻击小鼠后6周，肺组织病理改变：阴性对照组的改变，主要为大量的浆液纤维素性和少量的淋巴细胞渗出以及不同程度的肺组织坏死；阳性对照组主要表现为大量的淋巴细胞、组织细胞和类上皮细胞浸润以及结核肉芽肿的形成；以混合质粒组和AM免疫组病变和阳性对照组最为接近，其他各组介于BM组和阴性对照之间。脾组织的病理改变主要是炎性浸润和淋巴细胞的增生，阴性对照组主要表现为炎性浸润，阳性对照组主要表现为淋巴细胞的增生，混合质粒组和AM免疫组病变与BCG组相似，其余各组介于BM与阴性对照组之间。 8、小鼠存活时间以BCG组最长，混合质粒组和pcDNA/AM组次之，pcDNA3.1和PBS组最短。 结论： 1、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM DNA疫苗构建成功；pET/Ag85B、pET/MPT64能在大肠杆菌中表达，并分离纯化出rAg85B、rMPT64重组蛋白。 2、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64和pcDNA/AM能在COS-7细胞中分泌表达，且表达的蛋白具有免疫反应性。 3、本研究构建的DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫，其诱导能力以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM组最强，而pcDNA/AM组优于pcDNA/BM组。 WP=12 4、免疫小鼠经H37Rv标准株攻击后，PPD特异性抗体以pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM组最高； IFN-γ分泌水平以及脾淋巴细胞增殖能力以BCG、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64和pcDNA/AM组最高。提示DNA疫苗接种后可以通过提高特异性体液免疫和细胞免疫水平发挥抗感染作用。 5、组
【图文】：

31图 1-2 质粒 pcDNA/MPT64 构建的技术路线Fig1-2 Procedure for construction of plasmid pcDNA/MPT64三 构建质粒 pcDNA/AM

32图 1-3 Ag85B 和 MPT64 融合基因Fig1-3. Procedure for construction of the Ag85B and MPT64 AM2 pcDNA/AM 构建技术路线(Fig1-4.)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：2598263