可溶性钙网蛋白片段39-272对中国仓鼠卵巢细胞体内成瘤性的影响及其机制研究

发布时间：2020-03-24 17:47

【摘要】：钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一个定位于内质网中的多功能蛋白，全长CRT具有416个氨基酸序列，约46kDa，N端有一个17个氨基酸的信号序列，C端有KDEL的内质网滞留信号序列。CRT具有N，P和C三个结构域。其中P和C结构域具有超强的结合Ca~(2+)能力，维持胞内Ca~(2+)稳态，参与Ca~(2+)介导的信号通路。此外，CRT在内质网中行使其分子伴侣的功能，通过N-domain的凝集素结合序列保证新合成蛋白的正确折叠。越来越多的证据表明CRT在细胞膜上也发挥着重要的生物学功能，包括介导细胞粘附，参与凋亡细胞清除等。此外，病理状况下体液中可溶性CRT的存在也屡见报道，包括自身免疫病、肿瘤等。临床以及实验室的数据都提示CRT与肿瘤的发生发展关系密切，主要体现在：1）CRT在肿瘤组织中高表达或在体液中出现对于肿瘤具有一定的辅助诊断价值；2）高表达CRT的肿瘤细胞转移能力更强；3）可溶性CRT抑制肿瘤血管新生；4）膜型CRT介导肿瘤细胞免疫原性死亡（immunogenic death）。本实验室的前期工作显示，原核表达CRT片段39-272（rCRT/39-272）具有较强的免疫刺激活性及佐剂效应。本课题的主要内容是围绕CRT与肿瘤发生发展的关系，结合其对免疫系统的调节作用，利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株考察可溶性CRT对细胞体内成瘤性的影响并探索其机制。我们构建了eCRT/39-272的真核表达载体，并获得了持续分泌eCRT/39-272的稳转细胞株，从培养上清中用镍柱纯化得到真核重组表达的eCRT/39-272。体外实验表明，eCRT/39-272可刺激小鼠腹腔巨噬细胞(PMC)分泌炎性因子TNF-α、IL-6，NO，且其发挥功能依赖于TLR4所介导的信号通路。对持续分泌eCRT/39-272的CHO细胞株及其对照细胞株体外成瘤指标考察发现分泌eCRT/39-272不影响CHO细胞体外的增殖速度、克隆形成能力，但增强了CHO细胞的粘附和迁移能力。与裸鼠皮下接种CHO-eCRT/39-272及其对照细胞CHO-EGFP， CHO-eCRT/39-272成瘤率显著高于CHO-EGFP，且肿瘤体积比CHO-EGFP大约二倍。进一步的研究表明裸鼠左右两侧皮下同时接种CHO-eCRT/39-272和CHO-EGFP，血清中存在的eCRT/39-272并不促进CHO-EGFP肿瘤的生长。分析荷瘤小鼠外周血以及脾脏中的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的抑制细胞（MDSC）、自然杀伤细胞比例，发现并无明显差异。对肿瘤组织局部浸润的免疫细胞进行分析发现，肿瘤组织局部的MDSC细胞比例显著增加，提示其可能参与了体内肿瘤的生长。同时对肿瘤组织局部进行细胞因子表达检测，发现与MDSC迁移相关的趋化因子CCL5上调，并且非免疫系统依赖的效应分子金属基质蛋白酶MMP-2表达增加。综上所述，与前期描述的CRT作为血管抑素抑制肿瘤生长的作用不同，持续分泌表达eCRT/39-272的CHO细胞体内成瘤性显著增强，这种促肿瘤的作用可能与肿瘤局部高浓度eCRT/39-272促进MDSC的募集相关。但是可溶性CRT介导的MDSC促进肿瘤生长的具体机制及其对MDSC增殖分化的影响还需要进一步研究。这一研究为更立体地看待CRT在肿瘤发生发展中的作用提供了一个新的立足点。
【图文】：

分泌型,蛋白

图3-1 eCRT/39-272分泌型蛋白设计Figure 3-1 Design of eukaryotic CRT/39-272 protein A) plasmid profiles of pDisplay vector; B)plasmid profiles of pIRES2-EGFP vector; C) Schematic representation ofpIRES2-eCRT/39-272-EGFP construction. For expression of eCRT/39-272 protein, the MurineIgκ-chain leader sequence from pDisplay vector together with CRT/39-272 sequence, weresubcloned into pIRES2-EGFP vector.23

质粒,转染,荧光蛋白,脂质体转染

图 3-2 pDisplay-eCRT/39-272 和 pIRES2-eCRT/39-272 载体的构建Figure 3-2 Construction of pDisplay-eCRT/39-27 and pIRES2-eCRT/39-272 a) PCR product ofeCRT/39-272; (b) BglII SalI double digestion of the pDisplay-eCRT/39-272 plamid; (c) PCRproduct of soluble eCRT/39-272; (d) XhoI EcoRI double digestion of pIRES2-eCRT/39-272 plasmidAll the DNA products were run on 1% agarose gels with DNA ladders loaded in the left lane.3.2 pIRES2-eCRT/39-272 在 CHO 细胞中的表达为了检测重组质粒在体外能否有效表达，采用脂质体（Lipofectamine-2000）转染法将pIRES2-eCRT/39-272质粒瞬时转染CHO细胞，同时转染pIRES2-EGFP质粒做对照。转染48h后，荧光显微镜下观察表达EGFP荧光蛋白的细胞比例，，发现脂质体转染pIRES2-eCRT/39-272和pIRES2-EGFP空质粒效率均高达70%-80%（图3-3）。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】