6A8基因的功能研究：蛋白质糖基化和淋巴细胞死亡

发布时间：2020-03-24 18:39

【摘要】：机体的蛋白质大多以糖蛋白或称糖复合物的形式存在。蛋白质上的聚糖不仅对蛋白质的折叠、成熟、装配、稳定性和降解、以及蛋白质的生物学活性等方面有着重要的调节作用，而且其本身作为一种信息分子，在细胞-细胞、细胞-基质、细胞-分子和分子-分子间的相互作用，以及细胞的活化、增殖、分化和死亡等方面都有着重要的作用。但蛋白质糖基化和聚糖结构的多样性和复杂性使这方面的研究面临重重困难。蛋白质的糖基化是在多种糖酰基转移酶和糖苷酶的催化下进行的。编码这些酶的基因的不断发现和克隆对蛋白质糖基化和聚糖的生物学意义的研究起到了积极的推动作用，并得到了一些预想不到的结果。但迄今为止，有关这方面的研究进展还很小。因此，亟待作出更多的努力，以揭示蛋白质糖基化和聚糖的生物学意义，以及其作用产生和调节的规律。研究蛋白质糖基化可采用多种方法，反义核苷酸技术即为其中之一。 我们从一个人扁桃体cDNA文库中分离到了一个长为1358 bp的cDNA(6A8)，此cDNA与编码大鼠内质网α-甘露糖苷酶的基因有很高的同源性。α-甘露糖苷酶是一类蛋白质糖基化加工过程中重要的糖苷酶，负责聚糖中甘露糖的修剪。因此，6A8 cDNA的分离使我们能够介入蛋白质糖基化与细胞功能的研究。本实验室的研究已发现转染6A8 cDNA的反义DNA的人鼻咽癌细胞CNE-2L2肺转移率下降，运动性和侵袭性也受到抑制。本博士学位论文首先探讨了6A8 cDNA的性质，初步证明了其编码一种α-甘露糖苷酶。然后构建了腺相关病毒(AAV)载体pAGX(+)，并采用该载体介导6A8基因的正义和反义DNA转导入人淋巴细胞，研究干扰蛋白质糖基化对淋巴细胞功能的影响，结果发现转导反义6A8 DNA引起人B细胞BJAB发生oncosis，而使人B细胞SKW6和T细胞Jurkat对凋亡诱导产生耐受。 首先，依据Con A的配体是甘露糖，而α-甘露糖苷酶的作用是修剪细胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理，采用细胞免疫荧光染色法，观察经转染6A8 cDNA的正义或反义DNA重组表达载体后，细胞结合Con A的强弱，探讨6A8 cDNA编码的蛋白质是否为一种α-甘露糖苷酶。结果显示COS 7细胞和人鼻咽癌细胞株CNE-2L2转染pRc／CMV-正义6A8 DNA后与Con A结合减弱，而与单抗6A8染色增强；CNE-2L2细胞转染pRc／CMV-反义6A8 DNA后，与Con A结合增强，而与单抗6A8染色减弱。而转染空载pRc／CMV的CNE-2L2细胞和野生型细胞无明显差别。上述结果表明6A8 cDNA编码的蛋白质可能为一种α-甘露糖等酶，，且能被单抗6A8识别。 本实验室采用多组织Northern膜杂交表明，6A8基因在脾脏、淋巴结、胎肝中高表达，而在外周血白细胞、胸腺低表达。为进一步探讨6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在人免疫细胞中的表达情况，采用RT-PCR检测多种人免疫细胞株中6A8 mRNA的表达，可见6A8 α-甘露糖苷酶mRNA在B细胞株SKW 6高表达，在B细胞株3D5、BJAB、CESS、Daudi、Nalm 6中度表达，在B细胞株Navamlva，T细胞株GM、Jurkat，组织细胞瘤细胞株U937弱表达，在T细胞株Peer，慢
【图文】：

6A8cDNA的性质初探扫描共聚焦显微镜U(tlima212，Meridina公司，usA)观察细胞荧光RCclMV一正义6A8DNA或pRclcMv一反义6A8DNA后，细胞与合COS7细胞及CNE一2L2细胞转染pRcC/Mv一正义6A8DNA后，相应细胞相比，细胞与单抗6A8的反应加强，而与ConA结合则减CNE一2L2细胞转染pRcC/MV一反义6A8DNA后，细胞与单抗6A8而与CoAn结合增强(图2)ABC

pRclCMV一反义6A8后对单抗6A8染色反应seofimmunofiuoerscencestainingwithonAbindinginCNE一2L2eellsatfertare6A8DNA.A，wild一ytPeeells;B，cellstransefetedwihtPRc/CMV一natisense6A8DNA3D5Jurkat
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R392

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本文编号：2598697