铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的分子机制研究

发布时间：2020-03-25 02:07

【摘要】： 随着抗生素长期大量应用(包括滥用)，细菌耐药菌株随之大量出现，已成为感染性疾病治疗缺乏疗效的难题之一。细菌的耐药性引起了医学界及社会的极大关注，成为全球普遍关心的公共卫生问题，而搞清细菌耐药机制被认为是克服细菌耐药性的关键之一。 铜绿假单胞菌因其内在特点，对多种抗菌药物表现出天然或获得性耐药。因此，铜绿假单胞菌耐药株可作为研究细菌耐药的分子机制，研究开发抗耐药细菌药物的模型菌株。本研究首先从128株铜绿假单胞菌临床分离株中，获得大量对喹诺酮类药物耐药菌株；接着对耐药株Ⅱ类拓扑异构酶基因突变与耐喹诺酮类药物的关系，MexAB-OprM主动外排系统oprM结构基因的表达，mexR调节基因在MexAB-OprM外排系统中的作用以及gyrA基因突变与MexAB-OprM主动外排在细菌生物膜耐药机制中的作用等进行了较为深入的研究。通过对铜绿假单胞菌耐药的分子机制一步步的深入研究，无疑将加深人们对细菌耐药性理解。这对于合理使用抗菌药物，寻找抗菌药物作用的新靶点，指导研究开发新的抗菌药物，解决细菌耐药性问题等都具有重要意义。 128株铜绿假单胞菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性研究表 四川人学博卜学位论文 针J绿假单胞耐哇诺酮类药物的分了机制研究 明:铜绿假单胞菌对头饱曲松、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率高达 69.5%、57.8%和26.6%。其中，有17株对四种喳诺酮类药物呈交叉耐 药，占临床分离株的13.3%;13株对实验所用的抗菌药物表现出多重 耐药性，占临床分离株的10.2%。可见铜绿假单胞菌临床分离株耐药 的严重性。 用微量棋盘稀释法对哇诺酮与p一内酸胺类药物联合用药研究显 示，左氧氟沙星、环丙沙星与头饱他咤、呱拉西林联合用药对大多数 临床分离铜绿假单胞菌具有协同或相加作用，其抗菌活性明显增强。 因此，抗假单胞菌的p一内酞胺类药物与喳诺酮类药物联合用药治疗铜 绿假单胞菌感染是切实可行的。 对20株铜绿假单胞菌环丙沙星耐药株(从128株铜绿假单胞菌临 床分离的环丙沙星耐药株中按每一MIC浓度梯度随机挑选3株)H类 拓扑异构酶舒rA、岁rB、parC和parE基因的哇诺酮药物耐药决定区 基因突变与耐药性关系研究结果显示，90%的耐药株H类拓扑异构酶基 因发生了突变(20株中有18株)。突变主要发生在舒rA基因(18株) 和parC基因(10株)上，其中，了A基因的第83位氨基酸密码子表 现出高频突变(17株，ACC一ATC，占耐药突变株的94.4%)，只有2 株耐药株的多?B和parE基因分别发生单点突变。而发生2个以上基 因突变的变异株大都是高水平耐药株。在这些n类拓扑异构酶基因突 变耐药株中，有4株对所有试验的喳诺酮和p一内酞胺类药物都表现出 高水平的耐药。表明这些耐药株，除11类拓扑异构酶基因突变引起耐 药外，还可能存在其它形式的耐药机制。 对20株铜绿假单胞菌哇诺酮类药物耐药株的舒rA基因PCR产物进 行RFLP分析表明，用PcR扩增铜绿假单胞菌酬A基因的哇诺酮耐药 决定区，然后用SacH酶切扩增片段，可快速检测名厂A基因第83位氨 四川人学博!:学位论文 铜绿假单胞耐喳诺酮类药物的分子机制研究 基酸密码子发生点突变的铜绿假单胞菌哇诺酮药物耐药株。 用荧光法测定对环丙沙星不同敏感性的铜绿假单胞菌细胞内环丙 沙星蓄积量研究表明，多重耐药株细胞内环丙沙星稳定态浓度显著低 于敏感株;加入能量抑制剂碳酞氰基一对一氯苯踪，所有菌株细胞内环丙 沙星蓄积量增加，但只有多重耐药株细胞内环丙沙星的浓度增加显著， 表明多重耐药株具有主动外排作用。 MexAB一OPrM主动外排是导致野生型铜绿假单胞菌对多种抗生素 产生耐药性的主要因素。用PCR和DNA测序方法，对MexAB一OPrM 外排系统结构基因oprM研究表明，所有菌株的oprM基因未发生突变 或缺失。用RT一PCR方法研究oprM基因表达结果显示，只有多重耐药 株的oprM基因能在RNA水平上高表达，oprM基因的高表达导致 MexAB一OprM的主动外排。 对MexAB一OPrM外排系统的调节基因mexR的研究结果显示，铜 绿假单胞菌主动外排多重耐药株PNI和PN16的mexR基因编码第“ 位氨基酸的碱基发生了单点突变;将含有mexR突变基因的重组质粒 pMD 18一丁/mexR转化到了铜绿假单胞菌敏感菌队2中，重组菌PAZ获得 了对环丙沙星的部分耐药性。用RT一PCR方法在重组菌队2中扩增出 了oprM基因片段。这说明MexAB一OPrM主动外排系统，可能受mexR 基因的调控。因此，我们有理由相信，mexR基因将有可能成为筛选抑 制主动外排耐药系统药物的分子靶点。 生物膜细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力。 用绿色荧光蛋白基因(加)标记铜绿假单胞菌敏感株，选用特氟隆作为生 物膜形成的附着物，对铜绿假单胞菌舒rA基因突变和MexAB一OPrM主 动外排在细菌生物膜耐药中的作用进行研究。结果显示，，在生物膜形 成的过程中，生物膜细菌在MBC浓度的环丙沙星溶液中4小时的存活 四川大学博卜学位论文 铜绿假单胞耐哇诺酮类药物的分子机制研究 率，呈现出一个与细菌生长曲线相似的规律;无论是敏感株，还是 MexA
【图文】：

250bP100bP图2一2:PCR扩增产物灵敏度的琼脂糖凝胶电泳图谱FigZ一2:sensitivitiesofPCRamPlifieationofQRDRof岁rAgeneM:DNAmarker(DL2000);l~6:TheresultofPCRamPlifieationwithDNAconcentrationdeereaseprogressively(from3林g/mlto3.7sxlo‘林g/ml)33

1学位论文铜绿假单胞菌耐哇诺酮类药物的分子机制研究图2一1:铜绿假单胞菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱FigZ一1EleetroPhoresisofgenomieDNAof尸aerugi，10Sal一7:GenomieDNAofthedifferentstrainofPaeruginosa200ObPn尸卜Uo.n尸nUkU‘UnU几UnU

本文编号：2599221