人era基因的表达分布及其功能的相关研究

发布时间：2020-03-27 08:59

【摘要】： era基因是1986年测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，其编码的蛋白具有鸟苷酸结合活性，氨基酸序列与人和酵母的Ras有明显相似性，故命名为E.coli Ras-like（era）基因。后来的研究表明，era的同源序列存在于所有探讨过的细菌中，era编码的Era蛋白并不属于 Ras家族，其独特的C端使其成为一个新的G蛋白亚家族。 Era蛋白由两个结构域组成，N端是一个典型的鸟苷酸结合蛋白结构域，与其它G蛋白有较高的同源性；C端为Era家族所特有，，与其它蛋白家族无任何同源性，其中含有一个RNA结合功能结构域—KH结构域。大肠杆菌era是属于 rnc操纵元的一个细菌生存必需的基因，并参与细胞周期的调控，Era可以特异地与16S-rRNA结合。陈苏民教授在美国NIH工作期间，以大肠杆菌Era的C 端序列为靶序列，通过计算机搜索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌Era同源的EST序列，以此为线索，成功地克隆了人和小鼠全长的era-cDNA。在此基础上，本文对人Era的组织表达谱及其功能进行了相关研究。在本研究工作中，首先对人era的表达分布规律进行探索。1、人era-mRNA 的组织分布规律：以人era编码区基因为探针，用CLONTECH公司的MTN和MTE ＄四旱医大学俗士攀位论文第7 页杂交膜进行杂交，发现人。。－mRNA的大小为2．ZKb，分布于所有检测的组织和细胞系中，但表达水平有很大差异。表达最高的组织为心尖部、肝脏、胎肺和甲状腺。2、人。。。的蛋白表达分布规律：用课题组制备并经过亲和纯化的兔抗人 Era多克隆抗体对几种胎儿组织进行免疫组织化学染色，结果人Era蛋白分布于绝大多数所检测的组织，由强到弱依次为胰脏、肺、心脏、脾脏、胃、小肠、肝脏和肾脏。经免疫电镜检测大肠杆菌Era定位于胞浆膜的内侧面，其C端对细胞内定位有着重要意义。为分析人ERA在细胞内的定位，构建了人Era与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体pSMEGFP－hEra和PEGFP－CI－hEra，即目的蛋白分别位于荧光标签蛋白（EGFP）的N端和C端。瞬时转染NIH3T3细胞，带荧光的融合蛋白主要位于靠近核膜的胞浆部分；进一步用纯化的兔抗人Era多克隆抗体对类风湿关节炎滑膜细胞系RA，骨肉瘤细胞系MG63、胃癌细胞系7901等几种培养细胞进行问接免疫荧光检测，发现均有强弱不等的荧光，且主要分布于胞浆中。表明人 Era具有不同于大肠杆茵Era的细胞内定位，其细胞内分布以胞浆为主，可能具有与细菌Era不同的信号转导途径。为研究人Era对细胞形态、细胞周期的影响，进行以下工作：1、对人Era 的氨基酸序列进行了计算机分析，在此基础上构建了人Era的定点突变体，其突变的位置分别针对N端结构域的GTP结合位点和C端结构域的KH基序；2、带HA标签的野生型和突变型人Era的真核表达载体，转染Nll－I3T3细胞，筛选到稳定表达的细胞株。3、对稳定表达人Era细胞株的细胞形态和细胞周期进行分析，发现野生型人Era对细胞生长有促进作用，而KH基序突变后对细胞生长起抑制作用。流式细胞仪分析表明，转染野生型Era的细胞株表现为GZ期和S 期细胞增多，可能为DNA合成旺盛的结果；转染Era S36N细胞株各时相细胞所占百分数变化不明显；转染 Era 31 ON的细胞株 S期细胞和 GZ期细胞增多异常显著，结合细胞形态和生长曲线，可能存在细胞周期阻滞；即在细胞DNA复制后期不能向M期转化。进一步使用完全可调控诱导表达系统表达突变型人Era，以深入研究该蛋白的功能。在构建稳定高表达蜕皮激素受体基因的细胞株3V3的基础上，转染突变型人Era的表达载体进行压力筛选，对所得到的单克隆细胞株进行诱导与未诱 DopGI’－’’’ent ofBtochthe andMolecularmp FMMU2001 窜回旱医大学博士学位论文章吕页导条件下细胞周期的分析，结果表明未诱导加酒精的对照细胞可以引起细胞凋亡，而Era诱导表达后可以显著抑制凋亡细胞的数量，Western表明Era S36N 可以诱导细胞仇 1－2表达，提示人 Era可能与细胞凋亡相关。为进一步研究人Era的作用机理，对其结合蛋白的功能区进行鉴定，将人。。a基因克隆入融合表达载体 PRSETB中，转化大肠杆菌 BL21DE3（pLysS），经 IPTG诱导，表达6His－hEra融合蛋白。光密度扫描结果表明其占菌体总蛋白50％以上，表达产物分子量约为42KD，以包涵体形式存在。在SM i存在条件下，包涵体溶解，利用6Hk与过渡态金属离子N广高亲合力结合的性质，用N广一叮A 亲和树脂一步法纯化，即获得纯度达96％以上的6His－hEra融合蛋白。将纯化的蛋白进行包被，从噬菌体表面呈现随机十＝肽库中经过三轮淘筛（Biopanning），并用ELISA检测，筛选到具有人Era结合活性的阳性重组噬菌体克隆，测序后发现大多（7／9）具有 HxHSxxH的氨基酸序列，初步认为是人 Era的结合基序，为进一步Era结合蛋白基因的克隆及其功能研究提供了依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：Q784

【引证文献】