多种基因工程体系表达人肝细胞生长因子的研究和评价及基因治疗的实验初探

发布时间：2020-03-27 20:03

【摘要】：肝细胞生长因子是由日本学者Nakamura等从部分肝切除大鼠的肝脏中分离到一种能刺激原代培养的肝细胞DNA合成和生长的蛋白质因子，首次将之命名为肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor）HGF在目前已知的生长因子中是最强的促肝细胞分裂剂。现已证明HGF广泛分布于肝、肾、脾肺、脑、胰腺、甲状腺、唾液腺等处，是一种多效性因子，具有多种生物学功能，如促细胞分裂剂（mitogen）、促细胞运动剂（motogen）和促形态形成剂（morphogen）等作用。它不仅能特异性地刺激肝细胞DNA的合成,还可促进肺、肾、胰腺、胶质细胞等多种内皮和上皮细胞的分裂、分化及形态发生，参与机体重要组织器官损伤后的修复。随着人们对肝细胞生长因子研究的深入，如肝细胞生长因子结构与功能的关系、作用机制与临床应用价值等方面的研究， HGF的重要性日益受到了人们的关注。近年来，无论是在基础研究还是在开发应用研究领域均取得了较大进展。国内外研究人员都在积极探索获得HGF的方法和途径。在80年代末期，国外即开始尝试从病人血清或大鼠血清，血小板及肝脏中进行了HGF的分离纯化，并在其结构、功能和生物学特性等方面也做了较为深入的研究，取得了多方面的成功。随着研究的深入，特别是临床药用研究的开展，对HGF需求量日益增加，但从含量甚微的组织中提取活性HGF生产工艺，过程复杂，成本昂贵，产量甚微，缺乏实际意义。因此，由于来源的匮乏使其广泛应用极受限制。我们采用基因工程的方法表达目的基因，探索了建立高效表达和生产有野生活性的HGF基因工程表达体系的可能性。不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异，所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键，我们比较哺乳动物细胞表达体系、酵母表达体系、原核表达体系中HGF的表达水平及表达产物的生物学作用。作为一种多效性生长因子，具有多种生物学功能，HGF分别可促进人大动脉及大鼠冠状动脉血管内皮细胞的DNA合成，促进其增殖，但对血管平滑肌细胞的DNA合成则无影响。HGF的促进血管内皮细胞增殖作用与血管内 WP=6 皮细胞生长因子VEGF（vascular endothelial growth factor）相似，HGF可以增强VEGF导致的血管内皮增生。心绞痛、心肌梗塞的病理基础是血管内皮细胞的损伤、血管平滑肌细胞增殖纤维化造成的冠状动脉狭窄。血管内皮细胞有抗血栓，抑制平滑肌细胞增殖的作用，这些作用使其成为机体心血管系统防病的屏障。HGF以其促进血管内皮细胞增生的作用使其极有可能用于临床来治疗血管外伤、防止冠状动脉血管术后狭窄、防止和治疗动脉硬化，以其抗纤维化作用而用于心肌梗塞。我们探讨了HGF基因的自分泌表达对血管内皮细胞的增殖作用，为心肌缺血的基因治疗提供实验依据。本文作了以下几方面的研究工作，并取得相应的结果如下：第一部分：我们借鉴HGF分子自身合成加工特点，，提出对HGFcDNA进行转录前加工和修饰，探索了分别构建HGFα链、β链原核高效表达体系，采用异源蛋白共复性技术获得有活性人肝细胞生长因子的技术路线，探讨利用原核细胞基因工程体系获得有活性hHGF的可能性。（1）分别构建rhHGFα链、β链表达载体,并采用限制性内切酶酶切图谱法鉴定rhHGFα链、β链表达载体的质粒,酶切鉴定结果与预期一致。（2）SDS-PAGE检测工程菌表达产物的分子量与预期相符；Western Blot检测结果正确。（3）研究发酵工艺，研究了不同培养基成分、培养时间、诱导持续时间和分批补料对菌体生长和蛋白表达量的影响，得到优化的工程菌培养与诱导表达条件。（4）进一步进行包涵体分离纯化研究：分别研究了不同的细胞破碎工艺、包涵体洗涤和纯化工艺，得到优化的工艺路线为：超声波破碎、4M尿素洗涤，8M尿素溶解。（5）建立层析纯化工艺，产物纯度达95%。（6）复性样品经层析纯化后进行活性测定，采用MTT法测定复性样品对原代培养成年大鼠肝细胞增殖的影响，结果表明表达产物具有刺激肝细胞生长的活性。第二部分：建立了HGF哺乳动物细胞表达株，具体结果如下：以pRC-CMV作为真核细胞表达载体，构建含 HGFcDNA全系列的表达载体pRC/CMV-HGF。经筛选及限制性内切酶谱鉴定重组正确。 WP=7 以磷酸钙－DNA共沉淀法将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），以800μg/ml的选择压力用G418进行筛选15天左右，获得阳性克隆。将细胞克隆在200μg/ml G418浓度下维持筛选，扩大培养。用原代培养成年大鼠肝细胞对培养基上清进行活性测定。3H-TdR掺入分析证明，阳性克隆培养基上清可以明显刺激鼠肝细胞DNA的合成。表明重组人HGF基因在宿主细胞CHO中得到正确的转录和翻译，并将有生物活性的表达产物分泌到培养基中。第三部分：研究HGF甲醇营养型酵母—巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达。将HGF基因克隆到克隆载体pMD18－T 上，经酶切鉴定和序列测定鉴定正确后，再将HGF基因克隆到酵母表达载体pPIC9K上，得到重组质粒：pPIC9K－HGF，经酶切鉴定构建正确。（2）利用电转化方法，将重组质粒pPIC9K－HGF转化巴斯德毕赤酵母KM71,提取已转化的酵母基因组DNA，PCR鉴定筛选阳性重组子。（3）通过摇瓶诱导培养试验获得表达水平较高的工程菌.培养
【图文】：

示意图,成熟过程,示意图

HGF合成的加工成熟过程示意图

生长曲线,工程菌,生长曲线

山西医程菌诱导表达条件的优化工程菌生长曲线的制备及诱导起始时间的优化1.HGFα工程菌生长曲线的制备及诱导时间的优化绘制工程菌 30℃生长曲线，根据生长曲线（图 2-7）以较快的特点，将 30℃培养时间调整为 4.5h，42℃诱导时的蛋白得到高效表达（图 2-8）。600
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q78

【参考文献】