腺病毒载体中介Bcl-2基因转染对周围神经再生修复的影响

发布时间：2020-03-29 10:22

【摘要】： 近年来研究表明，各种原因导致的周围神经损伤，脊髓前角运动神经元均出现不同程度的凋亡。周围神经损伤后引起相应节段脊髓运动神经元的死亡，严重影响了周围神经的再生和功能恢复。因此，神经损伤后，如何保护濒临死亡的神经元，减少或阻止神经元凋亡的发生，已成为目前研究的热点之一。 复制缺陷型重组腺病毒作为一种高效基因转移载体，被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞，它不仅能感染分裂期细胞，也可感染非分裂期细胞，因此被认为是神经系统有效的基因转染载体，为神经系统基因治疗带来了希望。 Bcl-2(B-Lymphoma／Leukemia-2 gene)是调节细胞凋亡的基本成员，被认为能够抑制凋亡发生的“抗凋亡基因”。近年来研究表明，Bcl-2是中枢神经系统主要的神经保护性蛋白，提高Bcl-2的表达水平，不仅可保护神经元对抗不同的损伤因素，而且能促使哺乳动物神经系统轴突再生。通过损伤局部转染外源Bcl-2基因，是否能使位于中枢的脊髓运动神经元Bcl-2的表达增加，是否可对抗周围神经损伤导致的脊髓运动神经元凋亡，进而促使损伤的周围神经轴突再生和功能恢复?迄今为止，尚未见到相关报道。为此，本实验利用基因同源重组原理构建复制缺陷型重组腺病毒Ad／s-Bcl-2、Ad／as-Bcl-2和Ad／LacZ，分别中介Bcl-2正义、反义cDNA和LacZ cDNA的转染，通过腺病毒载体中介外源基因Bcl-2的转染，从离体和活体两个方面研究复制缺陷型重组腺病毒中介Bcl-2基因到脊髓运动神经元来促进周围神经再生的可能性。本研究获得以下主要结果： 1．成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒Ad／s-Bcl-2、Ad／as-Bcl-2和 AWhacZ。 2．Ad／s－Bcl2和Adias－Bcl工可感染原代培养的脊髓运动神经元并改 变神经元BC12的表达水平。转染AdiS司 的神经元无论是原位杂交还 一是免疫组化染色均较深，与其他三组比有显著性差异；转染 AdiAsE 的神经元BC12的表达被封闭，BC12原位杂交和BC12免疫组化染色均较 淡，，与其他组比有显著性差异；转染A山LacZ组和对照组间无显著性差异。 3．神经元过表达BC12可显著性对抗谷氨酸诱导的原代培养脊髓运动 神经元的凋亡，并显著性地降低谷氨酸诱导的神经元内ra》］i的增高。 Ad／s－BclZ组TUNEL阳性神经元显著性低于Adjas－Bcl－2组、Ad／LacZ组 。和谷氨酸组，神经元内［Cay］i也较后三者低，但较对照组高。Ad／as8＊2 组 TU’NEL阳性神经元显著性高于其它组，神经元内raz＋］i也较其它组高； AMiacZ组和谷氨酸组间无显著性差异，但两者均显著性高于对照组。 4．神经元过表达BC12可延长培养神经元生存。培养的第7、9天时， Adis－BclZ组吞噬台盼蓝染料的阳性神经元数较其它组少；AWhacZ和对 照组间无显著性差异；第7天时Ad／。S－BC12组吞噬台盼蓝染料的神经元数 较其它组多，第9天时，Adjas－BclZ组神经元几乎全部死亡。 5．在损伤周围神经处注射重组腺病毒载体，能在位于中枢的脊髓前 角运动神经元中检测到外源基因的表达。结果表明重组腺病毒能通过周围 神经进入中枢，神经元染色7天时达高峰，以后逐渐降低，表达持续1月 左右。此结果也为脊髓基因治疗提供潜在的治疗方法，可避免在CNS不必 要的操作。 6．周围神经切断损伤后脊髓前角运动神经元发生凋亡，表明神经元的 凋亡可能为成年大鼠周围神经损伤引发神经元死亡的主要病理过程。过表 达BCI．2可对抗周围神经损伤诱导的脊髓运动神经元的凋亡。AdiS－BC12 组大鼠脊髓TUNEL阳性神经元较其它组少；Adi8S－BC12组TUNEL阳性 神经元最多。注入Ad／LacZ和生理盐水组，两组脊髓TUNEL神经元间无 显著性差异。 7．BCI．2在脊髓运动神经元中过表达可促进损伤神经的再生和功能恢 Vll 复。过表达k．2可使脊髓运动神经元GAP43表达增加，并加速AChE活 性和SFI恢复。 结论：重组腺病毒载体能介导BclZ基因在周围神经损伤局部转染， 使位于脊髓的运动神经元过表达BC12，提高神经元凋亡的阈值，从而有效 地对抗周围神经损伤导致的脊髓运动神经元的凋亡，进而促进神经再生和 功能恢复，为周围神经再生的基因疗法奠定理论和实验基础。
【图文】：

一ZpA佣cl一2的构建Figl一2eonstruetionofPAd/Bel一2

可用BamHI酶切鉴定Bcl一2cDNA插入方向的正反，正向插入时被BamHI酶切下一26obp的片段，命名为peDN刀sense一Bel一2;反向插入时被BamHI酶切下650bp片段，命名为pcDN刀antisense一Bel一2，如图1一4所示。bPbP

本文编号：2605837