【摘要】：背景：骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是TGF-p信号传导通路中BMP/GDF (growth and differentiation factor,生长与分化因子),MIS (Mullerian inhibiting substance,副中肾管抑制物)通路亚家族的配体分子,参与调节细胞的增殖、存活、分化和凋亡等生物过程。研究已表明,曼氏血吸虫体内存在BMP信号传导通路,但是未见有关日本血吸虫BMP分子的研究报道,其在日本血吸虫的生殖发育以及卵胚发育与成熟过程中的作用有待研究。 目的：本研究旨在获得日本血吸虫骨形成蛋白基因(Schistosoma japonicum bone morphogenetic protein, SjBMP)的全长cDNA,并探讨其在日本血吸虫的生殖发育、卵胚发育与成熟过程中的功能。 方法和结果：通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)得到SjBMP基因的全长cDNA(mRNA)含3,020个核苷酸(nucleotides, nt),编码产物包含928个氨基酸,C-末端含有TGF-p超家族的保守功能域结构。通过部分序列的比对(basic local aligment search tool, BLAST)分析,SjBMP与来自于曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni),真涡虫(Schmidtea mediterranea)和日本三角涡虫(Dugesia japonica)的BMP分子在氨基酸水平的一致性分别是68%、51%和43%。实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)的结果显示,SjBMP在日本血吸虫肺型童虫、肝门型童虫、雌雄成虫以及虫卵中均有表达,其中肺型童虫(-27倍)和虫卵(-37倍)中的SjBMP转录水平较高；雄虫的转录水平是雌虫的3倍多。原位杂交试验检测显示,SjBMP mRNA主要分布于雌雄成虫的体表、肠道等的上皮、雌虫的卵巢；免疫组织化学检测结果显示,雌雄成虫和虫卵内的BMP蛋白质广泛地分布于各组织中,无明显的组织特异性。SjBMP双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的体外RNA干扰(RNAinterference, RNAi)实验中,与空白对照组相比,SjBMP dsRNA处理一周的日本血吸虫成虫的SjBMP mRNA水平下降25%～98%(P0.05),EGFP dsRNA处理组的SjBMP mRNA水平无显著差异(P0.05)。SjBMP dsRNA处理2天的日本血吸虫雌虫产出的虫卵数量少于空白组,正常虫卵百分比低于空白对照组；日本血吸虫的产卵量和正常虫卵百分比在SjBMP dsRNA处理7天的实验组与空白对照组之间无统计学差异(P0.05),两组的大部分虫卵均卵壳,呈致密沙粒状,成串粘连在一起。成虫组织切片经HE染色未观察到两组成虫在组织形态上有明显的区别。 结论：RNAi介导的SjBMP基因沉默导致了体外培养的日本血吸虫成虫在早期的产卵能力下降,虫卵的形态发生改变,表明SjBMP参与了日本血吸虫的产卵及卵胚发育过程,其长期及代偿机制有待深入研究。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.24
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本文编号：2609418
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