神经调节素1在斑马鱼肠神经系统发育中的作用

发布时间：2020-04-03 19:26

【摘要】：目的克隆斑马鱼nrg1基因，检测nrg1在成年斑马鱼肠道及胚胎中的表达模式，了解nrg1是否与肠道发育相关。 方法从斑马鱼肠道和不同时期胚胎中提取总RNA，设计引物，扩增出nrg1基因，对不同物种nrg1进行同源性分析，并作系统发育树；再将nrg1克隆至pGEM-T easy载体，体外合成地高辛标记的RNA探针，原位杂交技术检测nrg1在成年斑马鱼肠道中及胚胎中的表达。 结果克隆出斑马鱼nrg1基因，经测序验证克隆正确，斑马鱼nrg1与人类的nrg1同源性较高，为67%。系统发育树分析得知nrg1在斑马鱼中的进化速度最快，然后依次为小鼠、鸡、人及大鼠，其中斑马鱼nrg1与小鼠的亲缘关系较近。Nrg1表达于成年斑马鱼肠道的粘膜层肠细胞中，杯状细胞中未见表达，在肌层和浆膜层均未见表达；在胚胎中，nrg1从囊胚期即开始表达，随后在原肠胚期及体节期均有较强表达,主要位于动物极；在咽囊期nrg1RNA表达较弱；孵化期开始nrg1水平升高，且在斑马鱼肠道位置可以检测到nrg1的表达，至120hpf（hours post-fertilization，受精后数小时）表达减弱。 结论斑马鱼nrg1与人类、小鼠、大鼠nrg1有较高的同源性，其中与小鼠的亲缘性较近。斑马鱼nrg1表达于成年斑马鱼肠道，在胚胎中自囊胚即开始表达，并表达于幼体的肠道中，提示nrg1可能与肠道的发育有关。 目的建立斑马鱼nrg1敲低及过表达模型，分析nrg1表达水平变化后的胚胎表型变化。 方法向斑马鱼胚胎共同注射吗啉代反义寡核苷酸（morpholino, MO）及EGFP-nrg1线性化载体，通过观察荧光强弱判断敲低效率；分别/共同注射nrg1MO及nrg1RNA，观察改变nrg1表达水平导致的胚胎表型变化。 结果共同注射nrg1-EGFP线性化载体及control-MO后，12hpf开始胚胎内即有有较强的荧光表达；共同注射nrg1-EGFP线性化载体及nrg1-MO后不能正常表达融合蛋白，绿色荧光明显减弱，说明nrg1可被nrg1-MO有效的敲低。与对照组相比，注射nrg1-MO后，可观察到斑马鱼胚胎死亡率较对照组高，孵出延迟，头部畸形，身体变短，躯体扭曲等改变，游动速度缓慢；注射nrg1RNA表型没有明显变化；注射nrg1-MO及nrg1RNA后，可部分补救MO所致表型变化。 结论ATG-MO能有效地敲低nrg1蛋白表达水平；干扰nrg1的表达能导致斑马鱼胚胎畸形，生长发育延迟甚至死亡。 目的研究nrg1对肠神经增殖、分化及迁移的影响。 方法将斑马鱼胚胎分为四组并做不同处理：对照组、nrg1敲低组、nrg1过表达组及nrg1回补组，收集各组不同发育阶段的胚胎（66，72，88，96，120及144hpf），将胚胎固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，蛋白酶K消化，洗涤，封闭，加入一抗：anti-phosphohistone H3（肠神经增殖）及anti-Hu mAb16A11抗体（肠神经分化及迁移），4℃孵育过夜，洗涤并加入对应的荧光二抗，洗脱二抗，荧光共聚焦显微镜下拍照。 结果敲低nrg1可使肠神经增殖减少；敲低nrg1后，分化的肠神经较对照组减少；过表达nrg1，分化的肠神经数目在四种干预中最多；回补nrg1，分化的肠神经数目较敲低组多，但较对照组及过表达组少。对照组中，肠神经元在66hpf主要位于肠道近端，在72hpf、96hpf肠神经由肠道近端向中段及尾端迁移，至120hpf迁移至尾端，数目较多。注射nrg1-MO后，在66hpf肠道近端存在肠神经元，而在72hpf、96hpf，肠神经由肠道近端向中段及尾端迁移过程停滞，至120hpf迁移至尾端肠神经数目较少。 结论Nrg1可影响肠神经增殖、分化过程，nrg1敲低后，肠神经前体细胞迁移至肠道近端之前的过程不受影响，而肠神经由肠道近端迁移至尾端这一过程停滞。 目的研究nrg1对肠神经系统发育相关基因表达水平的影响。 方法将斑马鱼胚胎分为四组并做不同处理：对照组、nrg1敲低组、nrg1过表达组及nrg1回补组，收集各组不同发育阶段的胚胎（36,48及60hpf），将胚胎固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，4℃固定过夜，蛋白酶K适度消化，杂交液65℃预杂交3h后,加入相应杂交探针65℃杂交过夜，封闭液封闭1h,加入地高辛标记的一抗4℃孵育过夜。PBST洗脱抗体3次，，每次30min, NBT/BCIP染色，显色后PBST洗涤，拍照或置于30%甘油/PBS中保存。 结果敲低nrg1后，肠神经系统发育相关基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh表达明显减少；过表达nrg1，以上基因水平均无明显变化；nrg1RNA可以拯救反义寡核苷酸引起的表型变化，以上基因表达水较敲低模型增多。敲低nrg1组与对照组相比，crestin在36hpf表达无明显变化,但在60hpf中表达较对照组减弱。 结论Nrg1表达异常可使肠神经系统发育相关基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh的表达改变，证明nrg1与肠神经发育紧密相关。敲低nrg1后crestin在肠神经迁移至肠道时仍有表达，但在肠道迁移过程中表达减少，提示nrg1主要在肠神经前体细胞达到肠道后才开始发挥作用。 目的研究nrg1对肠道迷走神经纤维发育及分布的影响。 方法将斑马鱼胚胎分为对照组及nrg1敲低组并做不同处理，收集96hpf与7dpf胚胎，固定于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中，蛋白酶K消化，洗涤，封闭，加入一抗Acetylated α-tubulin,4℃孵育过夜，洗涤并加入对应的荧光二抗，洗脱二抗，荧光共聚焦显微镜下拍照。 结果在96hpf，敲低nrg1后斑马鱼肠道迷走神经纤维粗大，紊乱，变短；在7dpf,可见对照组斑马鱼肠道内迷走神经纤维分布至肠道内，并呈网状排列，而敲低nrg1后未见神经纤维伸入肠道。 结论Nrg1不仅参与肠神经发育过程，也影响迷走神经纤维由肠道近端向远端延伸并分布至肠道壁内这一系列的过程。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R321

【共引文献】

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本文编号：2613603