人肝源性干细胞系的建立及其生物学特性研究

发布时间：2020-04-03 20:22

【摘要】：肝脏是体内物质代谢的一个重要器官。动物实验结果表明，在生理状态下肝细胞的更新和肝切除后肝脏的恢复主要是通过成熟肝细胞的有丝分裂来实现的。然而，在受到物理或化学因素的严重损伤后，肝脏结构和功能的恢复则主要是通过肝干细胞的增殖与分化来实现的。一般意义上的肝干细胞是指具有旺盛的增殖能力，并可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞。已有的证据表明，肝干细胞的分离培养及其深入研究对于肝脏发育、肝脏肿瘤和肝脏再生的发生机理以及其临床防治都具有重要的价值。目前对于肝干细胞的研究还处于分离、培养和建系的初级阶段，而且又主要集中于对啮齿类动物的研究。至于人肝干细胞的研究，有人报道过人胎肝来源的原始上皮细胞系(Malhj H，2002)，但其细胞系实际上是一个没有纯化(即未经筛选和克隆化培养)的混合培养物，而且在体外不能稳定生长(即伴有明显的自发分化现象)。本文在所在实验室成功分离培养了小鼠肝干细胞的基础上，拟从人胎肝中分离并建立可以在体外稳定长期培养的肝干细胞系，为肝脏肿瘤和肝脏再生等相关生物医学问题的认识提供一个全新的切入点，进而为各种因素所致的，包括肝功能衰竭在内的，肝脏代谢性疾病的细胞治疗研究提供细胞来源和相关的知识。本研究以4.5～6周的流产人胚胎作为分离肝干细胞的实验材料(因为已经知道，胎肝在胚胎发育的第4周开始发生，而且已经知道，此时的胎肝中的干细胞的含量相对较高)。经过对培养条件的不断优化和克隆化培养，最终建立了11个可以在体外长期稳定传代的细胞系，并将其命名为hFLSC(Human FetalLiver-derived Stem Cells)。这些细胞系具有相似的细胞形态、增殖能力和分子表型。在此基础上，本丈对其中的一个细胞系(编号FLO31204-2)的基本生物学特性进行了较为深入的研究，发现该细胞系具有如下特征： (1) hFLSC细胞形态为均一的小三角形。hFLSC细胞体积较小，细胞核较大，圆形，有1～3个核仁。细胞之间有较长的突起相连。在传代过程中该细胞的形态基本保持不变。超微结构观察发现该细胞核质比极大，且细胞质中细胞器极少。 (2) hFLSC细胞具有强大的增殖能力。目前该细胞系已在体外培养达7个月之久，传代25代以上，而且其增殖能力相对稳定.核型分析显示染色体数目正常，荷瘤实验表明该细胞系无致瘤性. (3) hFLSC细胞表达多种类型的分子标志.R不尸CR、免疫细胞化学和流式细胞分析结果显示，该细胞系不仅表达肝干细胞相关的分子标志(如AF尸、 ALB、CKS、CK18、CK19、GGT、DPPIV、e一Met、Thy一1和e一kit等)，而且还表达间质细胞的部分分子标志(如CO44、COZg、SOF一1等)，但不表达造血细胞的标志(如CO34和CO45)。其中流式分析显示CO44、CO29的表达率高达 99%以上，而免疫细胞化学分析显示AFP、ALB、CKS、CK18、GGT、DPPfV、 c一Met和c一kit等标志也几乎在全部细胞都有所表达，由此推测hFLSC可以共表达间质细胞和肝干细胞的相关分子标志。另外，R丁一尸CR检测显示hFLSC有多能性干细胞标志Oct4的表达，提示h厂LSC是胎肝来源的一种原始的干细胞。 (引体外诱导分化研究显示h FLSC细胞具有多潜能性.有研究表明丁酸钠可以诱导小鼠肝索细胞(hePatoblasts)向肝细胞方向分化(Rogler LE，1997)。在丁酸钠作用下，hFLSC的生长受到明显抑制，细胞变得扁平而宽大，核质比明显缩小，并有约10~15%双核细胞的出现。电镜下可见诱导后细胞的胞质内具有丰富的细胞器，以及大量的糖原颗粒，并可见到细胞间胆管样结构.RT-尸CR 结果显示白蛋白(albumin，ALB)在诱导后表达增强。酸性Sehiff’s(Periodie acid一Schiff，PAS)实验显示在诱导后的细胞胞质内出现大量糖原颗粒。这些结果提示，hFLSC在丁酸钠诱导下分化形成肝细胞。另外，胆管细胞标志CKlg、 OPPIV和GGT的表达也有所增强，提示hFLSC可以向胆管细胞方向分化.但可能由于这是一个平面的诱导分化体系，未见到明显的胆管样结构。因此我们正在尝试用Matrigel丫M基质胶诱导hFLSC向胆管细胞方向分化，目前尚未得到结果。其次，利用骨髓间充质细胞向脂肪细胞诱导分化的实验条件对hFLSC进行了诱导分化，发现其细胞形态变大，呈长而宽的梭形，，两天后镜下可见约10%的细胞胞质内出现折光率很高、大小不等的黄色脂滴样颗粒。十天后60%以上的细胞中可以见到脂滴样颗粒。第13天时，对其细胞用脂类特异性结合染料油红一0 染色，在约90%的细胞胞质内可见大小不等的红染脂滴.同时，用RT一PCR方法在这种细胞的mRNA中检测到了脂肪特异性标志物一过氧化物酶体增殖物激活受体2(Peroxisome Proliferators一etivated ReeePtorZ，PPAR vZ)一的表达，这说明了hFLSC具有向脂肪细胞分化的潜能.另外，在成骨诱导体系作用下，大多数hFLSC细胞变成扁平的立方形或多角形细胞，并可见折光率很高的钙化点出现.碱性磷酸酶染色可见有大约30%的细胞呈阳性，而且有!型胶原的表达.这些都提示h FLSC可以向成骨细胞方向分化.除此之外，本文也探讨了口一疏基乙醇(p一mercaptoethanol，BME)和全反式维甲酸(All一rans Retinoie ACid，ATRA)对h
【图文】：

形态图,相差显微镜,形态

hFLSC细胞体积较小，直径约8~10pm。细胞核较大，圆形，有1一3个核仁。形态呈小三角形，细胞之间有较长的突起相连。不同于典型的上皮样细胞的铺路石样外观，也非成纤维细胞的长梭形外观(图3)。电镜下可见细胞核质比极大，胞质内细胞器极少(图4)。图3:hFLSC在倒置相差显微镜下的形态(100x)图4:hFLSC细胞的超微结构

超微结构,细胞的

形态呈小三角形，细胞之间有较长的突起相连。不同于典型的上皮样细胞的铺路石样外观，也非成纤维细胞的长梭形外观(图3)。电镜下可见细胞核质比极大，胞质内细胞器极少(图4)。图3:hFLSC在倒置相差显微镜下的形态(100x)图4:hFLSC细胞的超微结构
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【引证文献】