成熟NKT细胞来源的诱导型多潜能干细胞单克隆小鼠的构建及其NKT细胞发育和功能的分析

发布时间：2020-04-10 07:27

【摘要】：目的：构建小鼠成熟自然杀伤T（Natural killer T，NKT）细胞来源的诱导型多潜能干细胞（NKT-induced pluripotent stem cell，NKT-iPSC）克隆小鼠，通过体内实验探讨NKT细胞命运是否由T细胞受体（T cell receptor，TCR）α链或α链和β链的基因重组决定，并为NKT细胞发育和功能的体内研究提供更有效的动物模型。 本研究应用由WT C57BL/6（B6）小鼠成熟NKT细胞重编程获得的NKT-iPSC，成功构建了两种NKT-iPSC克隆小鼠，分别为已重组Vα14基因和野生型Vβ基因的Vα14/WTVβ小鼠及已重组Vα14基因和已重组Vβ7基因的Vα14/Vβ7小鼠。 利用流式细胞术对两种NKT-iPSC克隆小鼠胸腺、脾脏和肝脏NKT细胞数进行检测，发现两种NKT-iPSC克隆小鼠三种器官NKT细胞数量均显著高于对照组小鼠（B6小鼠）。流式细胞术和qPCR结果显示，NKT细胞发育相关因子CD1d、Ly108、SAP、Fyn、Myb、Myc、Runx1、HEB及Egr2在NKT-iPSC克隆小鼠胸腺CD4/CD8双阳性细胞（NKT前体细胞所在细胞群）中表达水平与在B6小鼠中无显著区别。流式细胞术检测结果显示，两种NKT-iPSC克隆小鼠胸腺、脾脏和肝脏中CD4-IL-17RB+、CD4+IL-17RB+以及IL-17RB-NKT亚群细胞数均高于B6小鼠。体外利用PMA刺激NKT细胞后，通过细胞内荧光染色法检测IFNγ＋、IL-4＋及IL-17A＋NKT细胞的比率和数量，发现Vα14/WTVβ小鼠3种器官中产生IFNγ、IL-4和IL-17A的NKT细胞数均显著高于B6小鼠；而Vα14/Vβ7小鼠体内产生IL-4和IL-17A的NKT亚群细胞数在胸腺中明显少于B6小鼠，但在脾脏和肝脏中显著高于B6小鼠。利用流式细胞术检测未成熟标记CD24和CD62L在NKT-iPSC克隆小鼠胸腺及肝脏NKT细胞表面的表达，结果显示Vα14/Vβ7小鼠胸腺NKT细胞表面大量表达CD24和CD62L，而肝脏NKT细胞表面这两个标志物的表达则明显减低，提示Vα14/Vβ7小鼠体内NKT细胞在外周免疫器官中获得了功能的成熟。对两种克隆小鼠体内其他免疫细胞的分析发现，在NKT-iPSC克隆小鼠体内无γδT细胞以及CD4T细胞的发育受影响数量减少，而CD8T细胞、NK细胞、B细胞以及树突状细胞均正常发育。 本实验应用由B6小鼠成熟NKT细胞重编程获得的NKT-iPSC，成功构建了两种NKT-iPSC克隆小鼠。通过对两种NKT-iPSC克隆小鼠体内NKT细胞数量、发育、功能和成熟，以及其他免疫细胞发育的检测，证明TCR Vα14而非Vβ7基因的重组决定NKT细胞命运。此外，本研究可以证明NKT-iPSC克隆小鼠拥有较完全及发育正常的免疫系统，更利于NKT细胞发育和功能的体内研究。
【图文】：

-iPSC 克隆小鼠的构建体小鼠（chimera mouse）的构建和鉴定-iPSC 细胞注射入雌性 BALB/c 小鼠的囊胚，从该 BALB/c 小鼠所生毛色辨别得到 2 只嵌合毛色小鼠，分别命名为 iPSC-58 3E7-1 和-2。R 方法对其 TCR 基因型进行鉴定，结果显示两只小鼠均可见野生型α条带及已重组（Rearranged）TCRα条带（左）及 WT 和 Rearranged右），而对照B6小鼠则只可见WT TCRα及TCRβ条带而无Rearranged 3.1 所示。因此确定小鼠 iPSC-58 3E7-1 及 iPSC-58 3E7-2 的 TCR 基α14+/-Vβ7+/-。A!B!TCR! locus! TCR# locus!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!TCR! locus!V!14 Rearranged!

吉林大学博士学位论文根据小鼠基因型，将这些后代小鼠配对进行数次交配基因型分别为 Vα14+/+WTVβ及 Vα14+/+Vβ7+/+两种纯合子（NKT-iPSC-derived mouse），，分别命名为 Vα14/WTVβ小鼠B!TCR# locus!WT! Rearranged!E7-13E7-23!E7-13E7-23!TCR! locus! TCR# locus!V!14 Rearranged!V#7 Rearranged!-318bp!
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363

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本文编号：2621932