一个HSV-1刺激相关基因的克隆及其功能的初步分析

发布时间：2020-04-10 13:26

【摘要】：单纯疱疹病毒(HSV)是一种具有较强传染性的病原体，它是一种结构复杂的双链DNA病毒，在细胞内的复制过程中与宿主细胞之间表现有多种相互作用。HSV与受体的相互作用所导致的细胞基因反应是研究HSV感染不同细胞后会形成不同的感染过程及结果的基础。从这个意义上说，对于病毒结合受体所导致的细胞早期基因反应的分析，在探索细胞对病毒感染产生相应反应的机理，和由此机理所导致的各种可能的生物学意义而确定的临床治疗或诊断方法等领域内的应用都具有很大的意义。 本实验的研究重点是分析病毒感染诱导的差异基因所编码蛋白在细胞内的功能意义，通过HSV-1型病毒刺激KMB-17细胞后，进行差异显示分析，根据分析结果，克隆得到了一个差异基因，命名为HSV-1刺激相关基因(HSV-1 stimulation related gene 1，hsrg1)，经GenBank检索为一未知功能编码基因，全长1748bp，CDS全长为1641bp，我们将该基因克隆到谷胱甘肽转移酶融合表达载体(pGEX-5x-1)中，构建了pGEX-HSRG1表达质粒，在大肠杆菌BL21中获得了较高的表达，并采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化，获得较高纯度的目的蛋白，用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗体，蛋白印迹实验表明原核表达的HSRG1能被该抗体特异识别。该抗体在病毒刺激KMB-17细胞前后的免疫沉淀实验(IP)中亦表现出较好的特异性，显示我们所表达的HSRG1蛋白具有与天然蛋白相同的构象。多组织mRNA表达谱分析表明，hsrg1基因在骨骼肌、脑、心脏、皮肤等组织中有表达。 免疫沉淀实验(IP)的结果进一步证实了HSV-1刺激可使HSRG1蛋白的表达量明显增加；且该蛋白质能够被磷酸化。通过对HSRG1-EGFP融合蛋白在细胞内的动态观察，初步确定HSRG1定位于细胞浆内。生物信息学分析发现，hsrg1编码的蛋白质属于一个功能未明的SAND蛋白家族的成员，其中含有一个存在于多种真核生物中的保守的结构域。hsrg1基因定位于人染色体16q23.1臂上，5个外显子分布于约7kb范围内。 转染pcDNA-HSRG1的KMB-17细胞和未转染的细胞感染HSV-1后，两者的病毒滴度无明显变化，提示HSRG1蛋白表达量增加对HSV-1病毒的感染和复制无直接影响；利用RNAi技术将约400bp的dsRNA转入KMB-17细胞，经流式细胞仪检测，，实验组和对照组的细胞周期无明显差别。利用酵母双杂交系统初步确定，SV40的T抗原可以和HSRG1发生相互作用，并通过免疫共沉淀实验在细胞内证实这种相互作用的存在。 通过对HSRG1蛋白功能的初步研究并结合Internet及生物信息技术进行数据的分析整理，我们
【图文】：

hsgrl全基因的获得我们选取差异条带，将获得的差异显示片段切下后，再次进行CPR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图10，经狭缝印迹杂交，利用差异片段制备的探针在上述cDNA文库中发现一个eds全长为1748，ORF为1641bp的基因，命名为hsrgl(HSv一1stimulati。n

图11hsrgl序列测定FigllSequeneingofhsrgl董泞时蔗之君纶必带有Ec0RI位点的引物对克隆在pUC18中的hsrgl基因的完整ORF进行CPR扩1%琼脂糖凝胶电泳结果如图12。在小于2000bp处均扩增出hsgrl的特异条带。MPb姗攒撰ooI图12HSRGI基因PCR扩增
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R373

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 刘龙丁,董承红,董少忠,王丽春,胡方,赵红玲,李琦涵;HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化[J];病毒学报;2003年01期

2 李凌云,齐义鹏,渡边伦子,上田重晴;控制麻疹病毒血凝集性的重要功能位点[J];科学通报;1999年01期

3 李琦涵,董承红,王炯,王丽春,孙明,杨芳;两种病毒与细胞结合诱导的原癌基因早期表达[J];生物化学与生物物理学报;2000年02期

4 王炯,刘龙丁,孙明,董承红,王丽春,王晶晶,李琦涵;在HSVI感染细胞中类PEBP蛋白基因的克隆及分析[J];中国病毒学;2002年02期

本文编号：2622282