人ZNF268基因在早期胚胎发育中的特性和功能研究

发布时间：2020-04-18 16:20

【摘要】：早期胚胎是细胞生长、发育、分化最旺盛时期，大多数基因都处于活化状态，是发现和分离有重要功能新基因的极好材料。尽管小鼠等模式动物，对于我们认识哺乳类动物早期胚胎发育提供了许多重要信息，但它与人类存在着必然的差异。为此，我们根据实际情况和条件选择人早期胚胎为材料，进行人早期胚胎中表达的新基因的分离和功能研究。 在构建早期人胚胎cDNA文库的基础上，应用杂交筛选和表达标签(EST)分析技术从3-5周龄人胚胎cDNA文库中得到一个克隆子L30，应用5’RACE技术，克隆了其全长cDNA。经过对全长cDNA序列的测定及其结构特征的分析，证实L30为一个新的锌指蛋白基因，国际命名委员会命名其为ZNF268。为了研究ZNF268的生物学功能，我们分别在mRNA和蛋白质水平研究了ZNF268在不同器官和组织中的表达图谱，为进一步深入研究奠定基础。 以~(32)P标记的ZNF268cDNA特异片段(3’UTR)作为探针，通过Northern杂交技术，，检测了ZNF268在42种正常人成体器官和组织以及8种晚期胎儿器官中的表达。结果显示，除阳性对照外，检测的所有样品中均无明显的杂交信号。同时，从早期人胚胎(3-5周龄及3月龄)提取总RNA与ZNF268探针进行杂交，均得到了3.8kb的杂交条带。Northern结果表明ZNF268mRNA仅特异性表达于早期人胚，而在成人组织中不表达。 为了进一步在翻译水平研究ZNF268蛋白的表达，我们 构建了ZNF268重组原核表达载体，纯化在大肠杆菌中表达 的产物，制备了特异的zNF268抗体paZNF268ab。以 paZNF268ab抗体为依托，用Western印迹法检测出在4月 龄人胚胎肝脏组织中，有分子量为108KDa的ZNF268蛋白 的特异表达信号。进一步利用免疫组织化学方法检测 ZNF268蛋白在5周至7月龄人胚肝中的表达。结果显示 ZNF268蛋白在不同发育时期的人胎肝中表现出不同的表达 水平，其表达量随着胚龄增加、即胚肝分化发育成熟而下 降。由此可见ZNF268可能参与调控早期人胚肝的分化和发 育。免疫组织化学的结果还显示，ZNF268在早期的造血干、 祖细胞中表达。因此ZNF268也可能参与早期造血细胞的分 化发育，从而与早期人胚造血相关。 大多数锌指蛋白做为转录调控因子，在细胞中的表达 集中于细胞核中。而用免疫组织化学方法检测ZNF268蛋白 表达产物的定位时，发现ZNF268蛋白集中于细胞质中。为 了进一步确认ZNF268蛋白在细胞中的表达定位，构建了与 绿色荧光蛋白融合的部分及全长ZNF268表达载体，对在 COS7细胞中表达的不同ZNF268片段融合EGFP的蛋白质进 行细胞内定位。结果证实ZNF268蛋白的表达主要定位于细 胞质中。这一结果表明ZNF268不同与大多数的锌指蛋白， 其发挥功能可能是通过胞质内的调控途径。同时这一结果 为确定ZNF268的靶向物及研究ZNF268的功能奠定了基础。 在研究ZNF268表达产物的细胞内定位时，我们还观察 到ZNF268KRAB盒的表达产物定位于细胞核中。CZHZ型锌指 蛋白的KRAB盒具有和其它因子相互作用而介导转录抑制 的功能。ZNF268的KRAB盒保守性很高，可能同样是一个 转录抑制因子。细胞内定位的结果显示ZNF268的KRAB盒 主要集中于细胞核中，这与其它转录抑制因子定位于细胞 核中是一致的。为了研究ZNF268KRAB盒的功能，构建了一 系列含有ZNF268KRAB盒不同片段的真核表达载体;与含有 CAT基因的报告载体共转染细胞，分析ZNF268KRAB盒的转 录抑制活性。结果证实ZNF268的KRAB盒确实具有转录抑 制作用;并且KRAB一A是一个强抑制子，KRAB一B对KRAB一A 有协同作用。 在确证了ZNF268有转录抑制功能的基础上，我们希望 寻找ZNF268功能作用的靶向物。采用酵母双杂交技术，用 ZNF268蛋白作为“诱饵”，筛选18~24周龄(约4一6月龄) 的人胚肝文库。经过营养缺陷型筛选、X一a一gal和X一p一gal 筛选、及体外免疫共沉淀验证，得到一个与ZNF268蛋白相 互作用的蛋白质AHSG。研究表明，AHSG参与人胚肝的发育。 ZNF268蛋白与AHSG蛋白的互作说明，ZNF268可能通过与 AHSG协同作用而参与调控人胚肝的发育。同时，AHSG不仅 仅表达于肝脏，在骨髓生血基质中也有表达，并与多种血 液疾病相关，提示ZNF268潜在的与早期人胚造血的关系， 以及在某些特定情况下可能与某种疾病相关。 总之，本研究从转录和翻译水平分析了ZNF268在人早 期胚胎中的表达特征;研究了ZNF268的细胞内定位并分析 了其作用的靶向物。研究结果初步阐明了这一新的锌指蛋 白基因在人早期胚胎中的功能。
【图文】：

ZNF268及其多种转录本的结构图

翻译编码锌指区。进一步，的血样，利用RT一PCR技术到了另一个新的ZNF268的ZNF268一e与ZNF268一b相AB一A起始的位置有44bp了开放阅读框的变化，可能起始翻译编码锌指区不(
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R321

【共引文献】

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6 孙

本文编号：2632279