汉坦病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白部分片段在昆虫细胞中的融合表达及免疫学特性研究

发布时间：2020-04-21 18:14

【摘要】： 汉坦病毒主要引起肾综合征出血热（HFRS），对其结构蛋白的免疫学研究表明，病毒糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）都与保护性免疫有关，其中囊膜糖蛋白可刺激机体产生中和抗体，但其免疫原性较弱；NP的免疫原性最强，它诱生免疫保护的机制被认为与其可刺激机体产生细胞免疫应答有关。本室前期研究工作证明其抗原位点主要集中在S基因编码区5'端约 0.7Kb片段的编码蛋白上。进一步深入研究两种结构蛋白的相互关系并使之优势互补，，是HFRS基因工程疫苗的基础研究中亟待解决的问题。本研究首先将汉坦病毒76-118株M基因G1糖蛋白编码区（G1）与 S基因5'端约700bp片段（S0.7）进行拼接，构建了原核嵌合表达载体 pGEX-4T-2-G1S0.7和pGEX-4T-2-S0.7G1，分别转化入大肠杆菌中诱导表达，均获得预期大小的可与抗汉坦病毒NP抗体结合的融合蛋白，其中第四军医大学博士学位论文一 GISO刀的表达产物还可检测到微弱的糖蛋白结合活性，且免疫印迹结果显示其降解明显少于SO．7GI的表达产物。进一步构建了分别含 SO．7、GI、GISO．7或SO．7GI嵌合基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹检测证明，含SO．7片段的三种重组杆状病毒均在昆虫细胞中表达出相应的活性蛋白。其中GISO．7融合蛋白可同时被抗汉坦病毒NP及糖蛋白GI特异性单抗所识别，免疫印迹结果显示该蛋白分子量与预期完整融合蛋白大小相一致；而 SO厂GI的表达产物仅检测到与抗汉坦病毒 Np抗体的结合活性，且免疫印迹结果表明未获得完整融合蛋白。动物实验结果表明含 GI基因片段的重组杆状病毒也表达出有生物学活性的糖蛋白。用 SO．7、GI、GISO．7三种基因的昆虫细胞表达产物分别免疫小鼠，间接免疫荧光、ELISA、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验检测兔疫效果。结果表明，几种重组杆状病毒的表达产物在机体内均可刺激产生针对汉坦病毒的特异性体液免疫及细胞免疫应答。其中GISO．7刺激产生的抗体滴度最高，且可刺激机体同时产生特异性的抗汉坦病毒NP及GP 的抗体：各免疫组小鼠均有部分产生中和抗体：淋巴细胞增殖试验表明， GI SO．7免疫组小鼠脾细胞对 NP及 GP的增殖反应指数高于阴性对照组，并略高于 GI或 SO．7免疫组小鼠脾细胞的增殖反应指数。以上研究证明，将汉坦病毒 76－118株 S基因编码区 5’端约 0．7Kb片段与 M基因 GI编码区进行拼接，构建的含 GI SO．7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出有生物学活性的完整融合蛋白。该表达产物同时具备两种基因片段编码蛋白的特点，在小鼠体内既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫应答，且免疫效果优于 G！和 SO．7。本研究为 HFRS基因工程疫苗研制中选择合适的免疫组分提供了重要的理论和实验依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392

【引证文献】