恙虫病分子疫苗的初步研究

发布时间：2020-04-23 02:32

【摘要】：恙虫病又称丛林斑疹伤寒(Scrub typhus)，是通过恙螨叮咬而传播，临床上主要以突然高热、浅表淋巴结肿大、虫咬处溃疡焦痂和皮疹为特征，其病原体为恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)。尽管该病可用抗菌药如四环素、多西环素和氯霉素等进行有效治疗，但是再感染和复发经常发生。另外，还出现耐药性恙虫病东方体菌株。因此，用恙虫病疫苗对易感人群进行预防接种仍有必要。传统的恙虫病疫苗研究主要是集中在灭活和减毒的菌苗，但一直未获满意结果。因此，有必要应用新技术来开发新型恙虫病疫苗。 56kDa和47kDa蛋白是恙虫病东方体的主要外膜蛋白。研究证明，这两种外膜蛋白均存在菌体表面并具有良好的免疫原性，已成为恙虫病东方体亚单位疫苗的重要候选分子。58kDa蛋白是恙虫病东方体的热休克蛋白，属于Hsp60家族。恙虫病东方体58kDa蛋白抗原具有种特异性，提示该蛋白可能是一种潜在的保护性抗原。 本研究首先用PCR方法扩增了恙虫病东方体Karp株的47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因，并对这些基因片段进行了克隆和序列测定。将这些基因分别插入到表达质粒pQE30中，构建了单抗原基因重组原核表达质粒(pQE30／47、pQE30／56、pQE30／58)和双抗原基因重组的原核表达质粒(pQE30／56-47、pQE30／58-47)。用重组质粒转化E.coli和IPTG诱导重组子表达目的蛋白。SDS-PAGE分析证明重组质粒转化E. coli细胞分别表达了47kDa、56kDa、58kDa重组蛋白以及56-47kDa和58-47kDa融合蛋白；蛋白免疫印迹分析证明重组蛋白均可与恙虫病东方体Karp株免疫血清发生特异反应。 为研究表达蛋白的免疫原性，用Ni-NTA亲和层析柱将重组蛋白纯化后免疫Balb／C小鼠。在第一次加强免疫后第10天，用ELISA在免疫小鼠的血清中检测到特异性抗体，表明重组蛋白能够刺激机体产生体液免疫应答。用MTT法分析免疫小鼠的脾细胞，发现这些重组蛋白均能刺激同源蛋白免疫小鼠的脾脏淋巴细胞增殖，提示这些重组蛋白能够刺激机体产生细胞免疫应答。56-kDa重组蛋白诱导机体产生的体液免疫应答的水平最高，而47-kDa重组蛋白诱导机体产生的细 汕头大学医学院博七研究生学位论文 胞免疫应答的水平最高。56一47kDa融合蛋白诱导的体液和细胞免疫应答水平分 别与56一kDa重组蛋白和47一kDa重组蛋白所诱导的相当。 在第二次加强免疫后第14天，用10LD。，Karp株攻击免疫的小鼠，结果发现 56一47kDa融合蛋白免疫组的死亡率比56一kDa重组蛋白或47一kDa重组蛋白免疫 组低，与阴性对照组有显著差异。病理学检查显示56一47kDa融合蛋白免疫保护 小鼠的肺、肝、肾未发现明显病理变化，而死亡小鼠的这些脏器均有严重病变。 这些结果证明56一47kDa融合蛋白能更有效地诱导机体产生抗恙虫病东方体免疫 应答，提示56一47kDa蛋白含有Karp株56一kDa和47一kDa外膜蛋白的抗原表位， 既具有56一kDa外膜蛋白的良好体液免疫诱导性又具有47一kDa外膜蛋白的良好细 胞免疫诱导性。 用Karp株56和47一kDa蛋白基因分别构建了单个基因重组的真核表达质粒 pcDNA/47和pcDNA/56，并将这两个基因融合构建了双抗原基因重组的真核表达 质粒pcDNA/瑟一47，用重组真核表达质粒分别转染真核细胞(COS一7细胞)。用 56一和47一kDa蛋白免疫血清分别对转染的细胞作间接免疫荧光染色，结果证明 56一和47一kDa蛋白基因以及它们的融合基因均在相应的转染的细胞内表达了目 的蛋白。 将真核表达质粒pcDNA/47、pcDNA/56、pcDNA/56一47以肌肉多点注射的方 式免疫Balb/c小鼠。在第二次加强免疫后第10天采集免疫小鼠的血清做EL工SA 和收集脾细胞做淋巴细胞增殖试验，结果显示重组真核表达质粒联合同源重组蛋 白免疫的小鼠比单独用重组真核表达质粒免疫小鼠产生较高水平的特异性抗体 和特异性淋巴细胞增殖。Karp株的攻毒试验显示pcDNA/47或pcDNA/56免疫的 小鼠死亡率高于pcDNA/56一47免疫组，而裸pcDNA/56一47的免疫效果又显著低于 纳米脂质体包封的pcDNA/56一47。 本研究的结果表明56一47kDa融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株56一kDa 和47一kDa外膜蛋白的抗原表位和免疫原性，该融合蛋白能比单一外膜蛋白更有 效地诱导机体产生抗恙虫病东方体的体液和细胞免疫应答。用56一47kDa融合蛋 白基因构建的真核表达质粒免疫机体，也能有效地诱导机体产生抗恙虫病东方体 汇!头大学医学院博l:研究生学位论文 的体液和细胞免疫应答。56一47kDa融合基因与56一47kDa融合蛋白的联合免疫可 能是替代恙虫病东方体全菌抗原免疫的一种较理想的预防恙虫病东方体感染的 方式。
【图文】：

汕头大学医学院博士研究生学位论文以恙虫病东方体基因组DNA为模板，经PCR分别扩增出47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因，大小分别约等于1272bp(图1一l)、1179bp(图1一2)、149lbp(图1一3)，，与预期结果一致。122000bP1000bP1272bP图1一1Ot.Karp株47kDa成熟蛋白基因的扩增Fig.l一1AmPlificationof47kDaProteingenebyPCRLanel，DL2000standardmarker;laneZ，amPlifiedProduetof47kDamatureProteingene·l22000bP1000bP1179bP图1一2口t.Karp株56kDa蛋白基因的扩增Fig.l一2AmPlifieationof56kDaProteingenebyPCRLanel，DL2000standardmarker:laneZ，amPlifiedProduetof56功aProteingene·

在含氨节青霉素平板上选择阳性克隆。阳性克隆的质粒通过PCR及酶切鉴定证明目的基因已成功克隆到PGEM一T载体中，重组质粒分别命名为pGEM/47、pGEM/56、pGEM/58(图1一3)。12342000bP一1000bP一图1一4PCR鉴定阳性克隆子pGEM/47、pGEM/56、pG毗/58Fig.1一4IdentineationofPGE扮1147、PGEM/56、PGEMI58byPCRLanel，DL2000standardmarker:laneZ，PCRProduetsofPGEM/47elones;lane3，PCRProduetsofPGEM/58elones;lane4，PCRProduetsofPGEM/56clones·2.3目的基因的序列测定对克隆到T载体上的47kDa、56kDa、58kDa蛋白基因的序列测定表明，扩增的蛋白基因的碱基序列与己知的Karp株蛋白基因序列一致(见图1一5、6、7)。
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 黄建生,许谆,SaidA.SALEH,解咏梅,张明徽,任大明;HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年06期

2 徐兵,张兆山,李淑琴,舒东,俞守义,黄翠芬;大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年06期

3 李柳哲,石佑恩,江侃,宁长修,邓伟文;日本血吸虫多价DNA疫苗pBK-Sj26 (Sj32)-Sj23免疫效果的观察[J];同济医科大学学报;2001年05期

4 陈香蕊,牛华,张永国,张雪颖,于强;山西恙虫病立克次体分型及其56-kD蛋白基因序列分析[J];中国人兽共患病杂志;1998年03期

5 龙章富,高荣,孟民杰,武梅,李江凌,沈翼,巫雪艳,王丽焕,谢鸿观,殷雪,刘昆,郑勇,刘世贵;阳离子脂质体包裹CpG对猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗免疫效应的影响[J];中国兽医科技;2003年03期

本文编号：2637254