共培养兔髓核细胞诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化的研究

发布时间：2020-04-23 12:34

【摘要】： 目的：体外分离、培养、鉴定大鼠脂肪间充质干细胞和兔椎间盘髓核细胞。并建立永生化的脂肪间充质干细胞。运用Transwell培养法对大鼠脂肪间充质干细胞和兔椎间盘髓核细胞进行体外共培养,研究脂肪间充质干细胞与髓核细胞的近距离作用后,脂肪间充质干细胞表型的变化,为构建组织工程髓核提供优良种子细胞建立基础。 方法：从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪间充质干细胞,进行传代；同时取兔髓核细胞进行原代培养。通过倒置相差显微镜对两种细胞进行形态学观察,MTT法测定两种细胞增殖情况,并采用免疫细胞化学方法进行鉴定。使用LipofectamineTM 2000将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T/PUR转染脂肪间充质干细胞,进过嘌呤酶筛选,抗性克隆扩大培养取得永生化脂肪间充质干细胞。将永生化的脂肪间充质干细胞单独培养(对照组),并以1：1的比例和髓核细胞于Tranawell中进行共培养(实验组)。共培养15天后,采用组化、RT-PCR鉴定检测两组细胞中Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表达。 结果：经过免疫细胞化学方法证实取材分离并且纯化的细胞为脂肪间充质干细胞和髓核细胞。SV40Tag稳定转染进入脂肪间充质干细胞,命名为永生化脂肪间充质干细胞。实验组永生化脂肪间充质干细胞经过15天在Transwell中与髓核细胞共培养后,RT-PCR结果显示有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达,而对照组则无Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达;免疫组织化学染色显示实验组聚集蛋白聚糖表达阳性而对照组为阴性。 结论：运用显微取材和免疫学纯化技术可以成功分离出纯化的脂肪间充质干细胞和髓核细胞。通过SV40Tag稳定转染,可构建永生化脂肪间充质干细胞。在Transwell环境内非接触共培养,髓核细胞能够在体外诱导永生化脂肪间充质干细胞向永生化髓核样细胞方向分化,因此可以利用永生化的脂肪间充质干细胞治疗椎间盘退行性疾病。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【共引文献】

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本文编号：2637729