重组人TRAIL及突变体的原核表达和抗肿瘤生物活性研究

发布时间：2020-04-23 15:46

【摘要】：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL,也称为Apo-2L)是Wiley 1995年首次克隆成功的一种新的抗肿瘤细胞因子,属于TNF家族的一个成员,在人体的多种组织中如脾、肺、前列腺、胸腺和外周血淋巴细胞等正常组织均可发现其表达。人TRAIL蛋白编码281个氨基酸,它的基因位于染色体3q26。TRAIL与目前发现的TNF家族的其它主要成员,如TNF-α,TNF-β(也称为淋巴毒素或LT-α),淋巴毒素-β(LT-β),41BBL,OX40L,CD27L,CD30L,CD40L和FasL(CD95L,也称为Apo-1L)等配体均为Ⅱ型膜蛋白,可水解形成可溶性同源三聚体,参与调节机体内的许多重要生物功能。TRAIL除了在免疫调节和炎性反应方面起重要的作用外,还与TNF家族中的TNF-α、TNF-β、FasL配体可导致易感细胞凋亡。TRAIL与这些配体的区别在于,除可特异性导致肿瘤细胞发生凋亡外,不损伤正常细胞。这些细胞因子的跨膜受体含有死亡结构阈,与配体结合导致引起凋亡的一系列蛋白酶反应。本研究首先对合成的TRAIL寡核苷酸全长进行了诱导表达和纯化,获得了有活性的TRAIL蛋白,并验证其抗肿瘤效应。同时采用分子模建方法,对TRATL结构进行了缺失突变,得到了两个突变体,并对它们进行了热诱导表达,以便深入的研究结构与功能的关系,为TRAIL开发成新的抗肿瘤药物打下基础。 1.人TRAIL寡核苷酸全长合成及在大肠杆菌中表达和纯化 人TRAIL寡核甘酸全长843个碱基,我们对其分段合成,然后进行全长拼接,并改变其中的30个密码子,以纠正氨基酸偏性,更利于在原核载体中进行表达。核苷酸自动测序结果,与预想的序列一致。合成的产物亚克隆至pGEX-2T质粒构成TRAIL-pGEX-2T,然后转染受体菌DH-5α大肠杆菌。我们在低温30℃,用IPTG 0.4mM/L诱导TRAIL融合蛋白表达,得到了TRAIL融合蛋白。然后采用亲和层析方法纯化TRAIL蛋白。 2.TRAIL的抗肿瘤生物活性 用A172人胶质细胞瘤,B104神经母细胞瘤,SKNSH人神经母细胞瘤,
【图文】：

『军笋医劳群瑞些虏娜士后研男扮昔自动测序仪测定TRAIL基因序列见图1一2，图1一2显示合成的基因片段序列与我们纠正氨基酸偏性后的TRALI序列相符。图1一2TRA工L核普酸序列分析

中低分子量Marker。由大到小依次为:97，66，43，31，20，14.4KD。2345图1一5亲和层析纯化TRALI融合表达蛋白的SDS一PAGE检测纯化后TRA工L融合蛋白。2，TRALI融合蛋白的表达。3，TRA工L蛋白。4GST蛋白。5，中低分子量Marker。由大到小依次为:97，66，43，，31，20
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2637894