乙型肝炎病毒e抗原相互作用蛋白基因的克隆化及功能的初步研究

发布时间：2020-04-24 04:55

【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝细胞损伤的机制，与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用密切相关。而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因区编码的一种非颗粒性的分泌蛋白，随HBV复制而增加，临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一。因此研究HBeAg与肝细胞内蛋白的相互作用及其机理，能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，并为寻找有效防治方法提供新线索。 酵母双杂交技术是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的方法。本实验所采用酵母双杂交系统-3，基于两种单倍体酵母a和α型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用的机理，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率。我们利用该技术，根据中国HBV流行株序列设计引物，，应用多聚酶链反应(PCR)技术，由乙型肝炎患者血清中分离出HBeAg编码基因序列。经测序鉴定正确后，克隆入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109(a型)，表达后通过Western-blotting鉴定产物活性。随后与预转了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187(α型)进行配合，经营养缺陷和蓝白斑双重筛选，获得了HBeAg结合蛋白阳性克隆245株。提取阳性克隆酵母质粒，通过Cacl_2穿孔法转化大肠杆菌，接种于氨苄青霉素-LB平板，筛选阳性克隆并进行序列测定。测序结果在GenBank中进行生物信息学分析，发现未知功能的新基因有6条，已知蛋白基因35条。 博士论文--一摘要 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与HBeAg在体外也存在 相互作用，我们根据Genbank中提供的序列信息设计引物，以HePGZ细胞的 mRNA为模板，通过逆转录一PCR扩增出CD81及新基因AK026018的全序列，测 序鉴定后，经相应的限制性内切酶消化后，克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT 网织红细胞裂解物中进行体外翻译，掺入同位素3，s，与HBeAg进行体外免疫共 沉淀反应，经SDS一PAGE电泳，一20℃条件下放射自显影，再次证实上述蛋白间 结合作用的可靠性。 在新基因功能的研究方面，我们对HBeAg结合蛋白新基因AKO26018进行了 初步探讨。首先明确了该基因表达产物的亚细胞定位，主要位于细胞浆中;通过 其对HePGZ细胞基因表达谱芯片的研究，推测该基因可能在细胞中起着多种复杂 作用，可通过多种途径对许多类型基因表达进行调控或影响。通过过表达及SIRNA 抑制实验证实，在LZ .2.15细胞株中HBeAg的分泌量与细胞内AK026018 mRNA 的含量正相关。同时CD81过表达实验证实，随着cD81 mRNA量的增加HBeAg 的分泌量反而降低。因此推测AKo26018基因及cD81对HBeAg的分泌分别有促 进及阻碍作用。
【图文】：

HAg00marks;1:阳性结果;2:阴性结果;3:空白的鉴定结果:经双酶切后电泳鉴定(结果见图1.3)，可见与插入片的质粒片段，将此重组质粒命名为T-eAg。利用T7通公布中国HBV基因型流行株序列比较核酸及氨基酸88%一100%，同时存在移码及缺失突变。选取一株%%及100%，且OR卫正确的重组T-eAg质粒继续进

1:空质粒对照;2:阴性克隆;3:阳性克隆3，3重组结合域载体鉴定结果:重组结合域载体经双酶切后电泳鉴定(结果见图1.4)，可见与插入片段大小一致的片段及酶切后的质粒片段，将此重组质粒命名为pGBKT7一eAg。图1.4重组质粒pGBKT7一eAg的酶切鉴定MI:LalllbdaDN户口EeoRl+Hind111marks;MZ:DL一2000marks;1，2:阳性克隆;3:阴性克隆3.4酵母细胞转化鉴定结果:上述重组结合域载体pGBKT7一eAg用乙酸铿转化法，转入酵母细胞AHI的培养，酚一氯仿一异戊醇抽提，纯化DNA，应用PCR方法进行扩增，可见与预期大小一致的片段证明转化成功。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

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本文编号：2638551